उच्च-सामग्री माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए सेल्यूलर रेडॉक्स प्रोफाइलिंग
Summary
इस पत्र में इंटरेसेल्युलर आरओएस स्तरों के साथ-साथ मितोचोनड्रियल झिल्ली की क्षमता और आकृति विज्ञान के लिए एक उच्च-सामग्री माइक्रोस्कोपी वर्कफ़्लो प्रस्तुत किया गया है – संयुक्त रूप से सेल-ट्रांसमिशन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अणुओं का उपयोग करते हुए अनुयायी कोशिकाओं में रहने वाले जीवों में- मिटोकॉन्ड्रियल मॉर्फफ़ोन – 5- (और- 6) – क्लोरोमिथाइल -2 ', 7'-डाइक्लोरोडाइहाइड्रोफ्लोरेससेन डिसासेट, एसीटील एस्टर (सीएम-एच 2 डीसीएफडीए) और टेट्रामिथिलोहाडामाइन मेथिलिएस्टर (टीएमआरएम)।
Abstract
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) जीन की अभिव्यक्ति, प्रवासन, भेदभाव और प्रसार सहित आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करती है। हालांकि, अत्यधिक आरओएस स्तर ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति पैदा करता है, जिसके साथ डीएनए, लिपिड और प्रोटीन को अपरिवर्तनीय ऑक्सीडेटिव नुकसान होता है। इस प्रकार, आरओएस की मात्रा का ठहराव सेलुलर स्वास्थ्य की स्थिति के लिए एक सीधा प्रॉक्सी प्रदान करता है। चूंकि मिटोचोरडिया आरओएस के प्रमुख सेलुलर स्रोतों और लक्ष्यों में से हैं, मिटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के संयुक्त विश्लेषण और उसी कोशिका में आरओएस उत्पादन पैथोफिज़ियोलॉजिकल स्थितियों में एक दूसरे संबंध को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, एक उच्च-सामग्री वाली माइक्रोस्कोपी-आधारित रणनीति को इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों के साथ-साथ मात्रात्मक मात्रा के लिए विकसित किया गया था, मिटोकोंड्रियल झिल्ली क्षमता (ΔΨ एम ) और मिटोचोनड्रियल आकारिकी। यह स्वचालित वाइडफ़िल्ल्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और रहने वाले पक्षपाती कोशिकाओं का चित्र विश्लेषण पर आधारित है, जो बहु-अच्छी प्लेटों में उगता है, और स्टैनडी-सेल पारगम्य फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अणुओं के साथ सीएम-एच 2 डीसीएफडीए (आरओएस) और टीएमआरएम (एमएम और मिटोचोनड्रियल आकारिकी)। फ्लोराइमेट्री या प्रवाह-साइटमैट्री के विपरीत, यह रणनीति प्रायोगिक उत्तेजना के पहले और बाद में, उच्च स्टेटियोटेम्पोरल रिजोल्यूशन वाले व्यक्तिगत सेल के स्तर पर सबसेलुलर मापदंडों की मात्रा का ठहराव प्रदान करती है। महत्वपूर्ण रूप से, विधि की छवि-आधारित प्रकृति तीव्रता संकेतों के साथ-साथ रूपरेखाओं को निकालने की अनुमति देती है। संयुक्त फीचर सेट का प्रयोग एक्सप्पुप्पुलेशन, सेल प्रकार और / या उपचार के बीच मतभेदों का पता लगाने के लिए अन्वेषणपूर्ण और सांख्यिकीय बहुभिन्नरूपी डेटा विश्लेषण के लिए किया जाता है। यहां, परख का विस्तृत वर्णन एक उदाहरण प्रयोग के साथ प्रदान किया गया है, जो रासायनिक घबरने के बाद सेलुलर राज्यों के बीच स्पष्ट भेदभाव के लिए अपनी क्षमता साबित करता है।
Introduction
इंट्रासेल्युलर आरओएस की एकाग्रता सावधानीपूर्वक आरओएस उत्पादन और आरओएस डिफोजिंग सिस्टम के बीच एक गतिशील परस्पर क्रिया के माध्यम से विनियमित होती है। दोनों के बीच असंतुलन, ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति को उत्तेजित करता है। आरओएस के प्रमुख स्रोतों में मिटोकॉन्ड्रिया 1 है सेलुलर श्वसन में उनकी भूमिका को देखते हुए, वे इंट्रासेल्युलर सुपरऑक्साइड (ओ 2 – – ) अणुओं के थोक के लिए ज़िम्मेदार हैं। यह अधिकतर इलेक्ट्रान रिसाव से अधिकतर इलेक्ट्रान ट्रांसपोर्ट चेन के परिसर 1 में ओ 2 के लिए परिणाम होता है जिसके तहत मजबूत नकारात्मक आंतरिक मिटोचोनड्रियल झिल्ली क्षमता (Δψ मी ), अर्थात् मिटोकॉन्ड्रियल हाइपरपरॉलरेशन दूसरी ओर, मिटोकोंड्रियल विध्रुवण भी आरओएस उत्पादन में बढ़ोतरी से संबंधित है , जो कि कार्रवाई के कई तरीकों को इंगित करता है 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 इसके अलावा, विखंडन-फ्यूजन मशीनरी के प्रोटीन में रेडॉक्स संशोधनों के माध्यम से, आरओएस मिटोचॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान 9 को सह-विनियमित करता है .उदाहरण के लिए, विखंडन बढ़ते आरओएस उत्पादन और एपोप्टोसिस 10 , 11 के साथ सहसंबंधित है, जबकि फिलामेंटिक मितोचोन्द्रिया को पोषक तत्वों की भूख और संरक्षण से जोड़ा गया है एमटोफैजी 12 सेलुलर आरओएस और माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फफ़ोन के बीच के जटिल रिश्ते को देखते हुए, दोनों ही जीवित कोशिकाओं में एक साथ मात्रा निर्धारित होना चाहिए। ऐसा करने के लिए, एक उच्च-सामग्री इमेजिंग परख स्वचालित चौड़ा माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट जांच सीएम-एच 2 डीसीएफडीए (आरओएस) और टीएमआरएम (मिटोकोडायड्रियल Δψ एम और मोर्फोलॉजी) के साथ दाग वाले पक्षपाती सेल संस्कृतियों के चित्र विश्लेषण के आधार पर विकसित किया गया था। उच्च-सामग्री इमेजिंग एसपी की निकासी को दर्शाती हैएकाधिक पूरक मार्करों और स्वचालित छवि विश्लेषण का उपयोग करते हुए सेल्युलर फिनोटाइप्स के बारे में जानकारी ( अर्थात् बड़ी संख्या में वर्णनात्मक विशेषताएं) स्वचालित माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर कई नमूने समानांतर ( यानी उच्च-थ्रुपुट) में जांच की जा सकती हैं, जिससे परख की सांख्यिकीय शक्ति बढ़ती है। दरअसल, प्रोटोकॉल की मुख्य संपत्ति यह है कि यह एक ही सेल में एक से अधिक मापदंडों के एक साथ मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, और यह बड़ी संख्या में कोशिकाओं और शर्तों के लिए है।
प्रोटोकॉल को 8 भागों में बांटा गया है (नीचे प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित है): 1) एक 96-अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को सीडिंग; 2) शेयर समाधान, काम कर रहे समाधान और इमेजिंग बफर की तैयारी; 3) माइक्रोस्कोप की स्थापना; 4) सीएम-एच 2 डीसीएफडीए और टीएमआरएम के साथ कोशिकाओं का लोडिंग; 5) बेसल आरओएस स्तर और माइटोकॉन्ड्रियल morphofunction को मापने के लिए पहले लाइव इमेजिंग दौर; 6) टीर्ट -बटिल के अलावा दूसरा लाइव इमेजिंग राउंडप्रेरित आरओएस स्तरों को मापने के लिए पेरोक्साइड (टीबीएचपी); 7) स्वचालित छवि विश्लेषण; 8) डेटा विश्लेषण, गुणवत्ता नियंत्रण और विज़ुअलाइज़ेशन
परख मूल रूप से सामान्य मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट (एनएचडीएफ) के लिए विकसित किया गया था। चूंकि ये कोशिका बड़े और सपाट हैं, वे 2 डी विस्तृतफील्ड छवियों 13 , 14 में मिटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के आकलन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। हालांकि, मामूली संशोधनों के साथ, यह विधि अन्य पक्षपाती सेल प्रकारों पर लागू होती है। इसके अलावा, सीएम-एच 2 डीसीएफडीए और टीएमआरएम के संयोजन के बगल में , कार्यप्रवाह विभिन्न आणविक विशिष्टताओं 1 , 15 के साथ विभिन्न प्रकार के फ्लोरोसेंट डाई जोड़ी का अनुपालन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पत्र एनएचडीएफ में इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों और मिटोचोनड्रियल मॉर्फफ़ोन के साथ-साथ मात्रात्मक मात्रा में एक उच्च-सामग्री माइक्रोस्कोपी विधि का वर्णन करता है। इसका प्रदर्शन एसक्यूवी से इलाज वा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Materials
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
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