الخلوية الأكسدة التنميط باستخدام عالية المحتوى المجهري
Summary
تقدم هذه الورقة سير العمل المجهري عالية المحتوى لتحديد الكمي في وقت واحد من مستويات روس داخل الخلايا، فضلا عن إمكانات الغشاء الميتوكوندريا والمورفولوجيا – يشار إليها مجتمعة باسم مورفوفونكتيون الميتوكوندريا – في الخلايا الملتصقة الحية باستخدام الخلايا الخلوية جزيئات مراسل الفلورسنت 5- 6) -كلوروميثيل -2 '، 7'- ثنائي كلورودي هيدروفلورسئين دياسيتات، استر أستيل (سم-H 2 دسفدا) وتيتراميثيلرودامين ميثيلستر (تمرم).
Abstract
أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) تنظم العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك التعبير الجيني، والهجرة، والتمايز والانتشار. ومع ذلك، فإن مستويات روس الزائدة تحفز حالة من الإجهاد التأكسدي، الذي يرافقه الأكسدة لا رجعة فيه الضرر إلى الحمض النووي، والدهون والبروتينات. وبالتالي، الكمي من روس يوفر بديلا مباشرا للحالة الصحية الخلوية. منذ الميتوكوندريا هي من بين المصادر الخلوية الرئيسية وأهداف روس، التحليل المشترك لوظيفة الميتوكوندريا وإنتاج روس في نفس الخلايا أمر بالغ الأهمية لفهم أفضل للربط في الظروف الفيزيولوجية المرضية. لذلك، تم تطوير استراتيجية عالية المستندة إلى المجهري على أساس الكمي في وقت واحد من مستويات روس الخلايا، والغشاء الميتوكوندريا المحتملة (ΔΨ م ) والتشكل الميتوكوندريا. لأنه يقوم على الآلي ويبيدفيلد المجهر مضان وتحليل الصور من الخلايا الملتصقة الحية، نمت في لوحات متعددة جيدا، وستيند مع جزيئات مراسل الفلورسنت خلية نفاذية سم-H 2 دكفدا (روس) و تمرم (ΔΨ م والتشكل الميتوكوندريا). على النقيض من قياس الفلور أو التدفق الخلوي، وهذه الاستراتيجية تسمح الكمي من المعلمات تحت الخلية على مستوى الخلية الفردية مع ارتفاع القرار الزماني الزماني، قبل وبعد التحفيز التجريبي. الأهم من ذلك، فإن الطبيعة القائمة على الصورة من طريقة يسمح استخراج المعلمات المورفولوجية بالإضافة إلى شدة الإشارة. وتستخدم مجموعة الخصائص المجمعة للتحليل الاستكشافي والإحصائي للبيانات المتعددة المتغيرات لكشف الاختلافات بين المجموعات السكانية الفرعية وأنواع الخلايا و / أو العلاجات. هنا، يتم تقديم وصف مفصل للمقايسة، جنبا إلى جنب مع مثال التجربة التي تثبت قدرتها على التمييز لا لبس فيه بين الحالات الخلوية بعد الاضطراب الكيميائي.
Introduction
وينظم تركيز روس داخل الخلايا بدقة من خلال التفاعل الديناميكي بين روس إنتاج ونظم روس إزالة الغبار. الخلل بين اثنين يثير حالة من الاكسدة. من بين المصادر الرئيسية لل روس هي الميتوكوندريا 1 . نظرا لدورها في التنفس الخلوي، فهي المسؤولة عن الجزء الأكبر من الفوق الخلايا داخل الخلايا (O 2 • – ) جزيئات 2 . وهذا ينتج في معظمه من تسرب الإلكترون إلى O 2 في مجمع 1 من سلسلة النقل الإلكترون في ظل ظروف قوية سلبية سلبية الغشاء الميتوكوندريا الداخلي (Δψ م )، أي فرط الاستقطاب الميتوكوندريا. من ناحية أخرى، كان الاستقطاب الميتوكوندريا يرتبط أيضا مع زيادة إنتاج روس مشيرا إلى وسائط متعددة من العمل 3 ، 4 ، 5 ،> 6 ، 7 ، 8 . وعلاوة على ذلك، من خلال التعديلات الأكسدة في البروتينات من الانصهار الانشطار الآلات، روس تشارك في تنظيم التشكل الميتوكوندريا 9. على سبيل المثال، يرتبط تجزئة مع زيادة إنتاج روس والموت الخلايا المبرمج 10 ، 11 ، في حين تم ربط الميتوكوندريا الخيطية إلى المجاعة المغذية والحماية ضد ميتوفاغي 12 . ونظرا للعلاقة المعقدة بين روس الخلوية والميتوكوندريا مورفوفونكتيون، كلاهما ينبغي أن يكون مثاليا في وقت واحد في الخلايا الحية. للقيام بذلك بالضبط، وقد وضعت مقايسة التصوير عالية المحتوى على أساس المجهري ويديفيلد الآلي وتحليل الصور من الثقافات خلية ملتصقة ملطخة تحقيقات الفلورسنت سم-H 2 دكفدا (روس) و تمرم (الميتوكوندريا Δψ م و مورفولوجيا). التصوير عالي المحتوى يشير إلى استخراج سب( أي عدد كبير من السمات الوصفية) معلومات عن المظاهر الخلوية باستخدام علامات تكميلية متعددة وتحليلات الصور الآلية. عندما يقترن المجهري الآلي يمكن فحص العديد من العينات في موازاة ( أي عالية الإنتاجية)، وبالتالي زيادة القوة الإحصائية للمقايسة. في الواقع، أحد الأصول الرئيسية للبروتوكول هو أنه يسمح للكمي في وقت واحد من المعلمات متعددة في نفس الخلية، وهذا لعدد كبير من الخلايا والظروف.
وينقسم البروتوكول إلى 8 أجزاء (وصفها بالتفصيل في البروتوكول أدناه): 1) خلايا البذر في لوحة 96 جيدا. 2) إعداد حلول الأسهم، حلول العمل والتصوير العازلة؛ 3) إعداد المجهر. 4) تحميل الخلايا مع سم-H 2 دكفدا و تمرم. 5) الأولى الحية التصوير جولة لقياس مستويات روس القاعدية و مورفوفونكتيون الميتوكوندريا. 6) الثانية الحية التصوير جولة بعد إضافة -تيل البوتيلبيروكسيد (تبهب) لقياس مستويات روس المستحثة؛ 7) الآلي تحليل الصور؛ 8) تحليل البيانات، ومراقبة الجودة والتصور.
وقد وضعت في الأصل أصلا لالألياف الليفية البشرية البشرية الطبيعية (ندف). وبما أن هذه الخلايا كبيرة ومسطحة، فهي مناسبة تماما لتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا في 2D ويديفيلد الصور 13 ، 14 . ومع ذلك، مع تعديلات طفيفة، هذه الطريقة تنطبق على أنواع الخلايا الملتصقة الأخرى. وعلاوة على ذلك، بجانب مزيج من سم-H 2 دكفدا و تمرم، سير العمل يتوافق مع مجموعة متنوعة من أزواج صبغ الفلورسنت مع الخصائص الجزيئية المختلفة 1 ، 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الورقة طريقة عالية المجهر المحتوى للكمية في وقت واحد من مستويات روس داخل الخلايا و مورفوفونكتيون الميتوكوندريا في ندف. وأظهرت أدائها مع دراسة حالة عن ندف الصندوق العالمي للمصايد. النتائج تدعم الأدلة السابقة من الأدب التي زادت مستويات روس أو ضعف الميتوكوندري…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Materials
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. . shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor–saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- . Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006)
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O’Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O’Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
