Сотовая редокс-профилирование с использованием высококонцентрированной микроскопии
Summary
В настоящей статье представлен технологический процесс высококонцентрированной микроскопии для одновременной количественной оценки внутриклеточных уровней ROS, а также потенциала и морфологии митохондриальной мембраны – совместно называемой морфофункциональной функцией митохондрий – в живых адгезивных клетках с использованием флуоресцентных репортерных молекул клеток 5- (и / 6) -хлорметил-2 ', 7'-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат, сложный ацетил (CM-H 2 DCFDA) и метиловый эфир тетраметилродамина (TMRM).
Abstract
Реактивные виды кислорода (ROS) регулируют основные клеточные процессы, включая экспрессию генов, миграцию, дифференцировку и пролиферацию. Однако чрезмерные уровни ROS вызывают состояние окислительного стресса, что сопровождается необратимым окислительным повреждением ДНК, липидов и белков. Таким образом, количественное определение ROS обеспечивает прямой прокси для состояния клеточного здоровья. Поскольку митохондрии входят в число основных клеточных источников и мишеней АФК, совместный анализ митохондриальной функции и продукции АФК в одних и тех же клетках имеет решающее значение для лучшего понимания взаимосвязи в патофизиологических условиях. Поэтому была разработана стратегия с высоким содержанием микроскопа для одновременной количественной оценки внутриклеточных уровней ROS, потенциала митохондриальной мембраны (ΔΨ m ) и морфологии митохондрий. Он основан на автоматизированной флуоресцентной флуоресцентной микроскопии и анализе изображений живых клеток, выращенных в многолуночных планшетах, и стеанеD с клеточно-проницаемыми флуоресцентными репортерными молекулами CM-H 2 DCFDA (ROS) и TMRM (ΔΨ m и митохондриальной морфологией). В отличие от флуориметрии или проточной цитометрии эта стратегия позволяет количественно определять субклеточные параметры на уровне отдельной клетки с высоким пространственно-временным разрешением, как до, так и после экспериментальной стимуляции. Важно отметить, что основанный на изображении характер метода позволяет экстрагировать морфологические параметры в дополнение к интенсивностям сигналов. Комбинированный набор функций используется для исследовательского и статистического многомерного анализа данных для выявления различий между субпопуляциями, типами клеток и / или обработками. Здесь приводится подробное описание анализа, а также примерный эксперимент, который доказывает его потенциал для однозначного различения между клеточными состояниями после химического возмущения.
Introduction
Концентрация внутриклеточных ROS тщательно регулируется посредством динамического взаимодействия между ROS-продуцированием и системами разжижения ROS. Дисбаланс между ними провоцирует состояние окислительного стресса. Среди основных источников ROS – митохондрии 1 . Учитывая их роль в клеточном дыхании, они отвечают за объем внутриклеточных молекул супероксида (O 2 • – ) 2 . Это в основном связано с утечкой электрона в O 2 в комплексе 1 цепи переноса электронов в условиях сильного отрицательного внутреннего мембранного потенциала митохондрий (Δψ m ), т.е. митохондриальной гиперполяризации. С другой стороны, митохондриальная деполяризация также коррелирует с увеличением продукции ROS, указывая на множественные способы действия 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Кроме того, с помощью окислительно-восстановительных модификаций в белках механизмов деления-слияния РОС совместно регулирует митохондриальную морфологию 9. Например, фрагментация коррелирует с повышением продукции АФК и апоптозом 10 , 11 , тогда как нитевидные митохондрии связаны с питательным голоданием и защитой от Митофагия 12 . Учитывая сложную взаимосвязь между клеточной АФК и морфофункциональной функцией митохондрий, в идеале их следует количественно определять одновременно в живых клетках. Для этого был разработан анализ изображений с высоким содержанием, основанный на автоматизированной широкополосной микроскопии и анализе изображений клеточных культур, окрашенных флуоресцентными зондами CM-H 2 DCFDA (ROS) и TMRM (митохондриальная Δψ m и морфология). Отображение с высоким содержанием относится к извлечению sp(То есть , большое количество описательных признаков) информацию о клеточных фенотипах с использованием множественных комплементарных маркеров и автоматизированный анализ изображений. В сочетании с автоматизированной микроскопией многие образцы можно скринировать параллельно ( т.е. с высокой пропускной способностью), тем самым увеличивая статистическую мощность анализа. В самом деле, основным преимуществом протокола является то, что он позволяет одновременно количественно определять несколько параметров в одной и той же ячейке, и это для большого количества ячеек и условий.
Протокол разделен на 8 частей (подробно описанных в протоколе ниже): 1) Посеяющие клетки в 96-луночном планшете; 2) приготовление исходных растворов, рабочих растворов и буфера для визуализации; 3) Настройка микроскопа; 4) загрузка клеток DCFDA и TMRM CM-H 2 ; 5) Первая визуализация в реальном времени для измерения базальных уровней ROS и митохондриальной морфофункциональности; 6) Второе изображение в реальном времени после добавления трет -бутилПероксид (TBHP) для измерения индуцированных уровней ROS; 7) Автоматизированный анализ изображений; 8) Анализ данных, контроль качества и визуализация.
Этот анализ был первоначально разработан для нормальных человеческих дермальных фибробластов (NHDF). Так как эти клетки большие и плоские, они хорошо подходят для оценки морфологии митохондрий в двумерных широкопольных изображениях 13 , 14 . Однако, с небольшими изменениями, этот метод применим к другим типам адгезивных клеток. Кроме того, рядом с комбинацией DCFDA CM-H 2 и TMRM рабочий процесс соответствует множеству пар флуоресцентных красителей с различными молекулярными особенностями 1 , 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной статье описывается метод микроскопии высокого содержания для одновременной количественной оценки внутриклеточных уровней ROS и митохондриальной морфофункциональности в NHDF. Его эффективность была продемонстрирована на примере исследования SQV-обработанных NHDF. Результаты под…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Materials
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. . shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor–saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- . Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006)
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O’Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O’Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
