Este trabalho apresenta um fluxo de trabalho de microscopia de alto conteúdo para a quantificação simultânea dos níveis intracelulares de ROS, bem como o potencial e morfologia da membrana mitocondrial, denominados conjuntamente como morfofunção mitocondrial, em células vivas aderentes, 6) -clorometil-2 ', 7'-diclorodihidrofluoresceína, éster acetilico (CM-H 2 DCFDA) e éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM).
As espécies reativas de oxigênio (ROS) regulam os processos celulares essenciais, incluindo a expressão gênica, migração, diferenciação e proliferação. No entanto, níveis excessivos de ROS induzem um estado de estresse oxidativo, que é acompanhado por danos oxidativos irreversíveis ao DNA, lipídios e proteínas. Assim, a quantificação de ROS fornece um proxy direto para condição de saúde celular. Uma vez que as mitocôndrias estão entre as principais fontes e alvos celulares de ROS, a análise conjunta da função mitocondrial e da produção de ROS nas mesmas células é crucial para melhor compreensão da interconexão em condições fisiopatológicas. Portanto, desenvolveu-se uma estratégia baseada em microscopia de alto conteúdo para quantificação simultânea dos níveis intracelulares de ROS, potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ m ) e morfologia mitocondrial. É baseado em microscopia de fluorescência de campo largo automatizada e análise de imagem de células aderentes vivas, cultivadas em placas de múltiplos poços, e staineD com as moléculas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) e TMRM (ΔΨm e morfologia mitocondrial) permeáveis às células. Em contraste com a fluorimetria ou citometria de fluxo, esta estratégia permite a quantificação dos parâmetros subcelulares ao nível da célula individual com elevada resolução espaço-temporal, tanto antes como depois da estimulação experimental. É importante notar que a natureza baseada em imagens do método permite extrair parâmetros morfológicos além das intensidades de sinal. O conjunto de recursos combinados é usado para análise de dados multivariada exploratória e estatística para detectar diferenças entre subpopulações, tipos de células e / ou tratamentos. Aqui, é fornecida uma descrição detalhada do ensaio, juntamente com um exemplo de experiência que comprova o seu potencial para discriminação inequívoca entre estados celulares após perturbação química.
A concentração de ROS intracelular é meticulosamente regulada através de uma interacção dinâmica entre a produção de ROS e sistemas de desactivação ROS. O desequilíbrio entre os dois provoca um estado de estresse oxidativo. Entre as principais fontes de ROS estão as mitocôndrias 1 . Dado o seu papel na respiração celular, são responsáveis pela maior parte das moléculas intracelulares de superóxido (O 2 • – ) 2 . Isto resulta principalmente da fuga de electrões para O 2 no complexo 1 da cadeia de transporte de electrões em condições de forte potencial negativo interno de membrana mitocondrial (Δψ m ), isto é , hiperpolarização mitocondrial. Por outro lado, a despolarização mitocondrial também tem sido correlacionada com o aumento da produção de ROS apontando para múltiplos modos de ação 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Além disso, através de modificações redox em proteínas da maquinaria de fusão-fissão, ROS co-regular a morfologia mitocondrial 9. Por exemplo, a fragmentação está correlacionada com o aumento da produção de ROS e apoptose 10,11, enquanto as mitocôndrias filamentosas têm sido associadas à inanição de nutrientes e proteção contra Mitófago 12 . Dada a intrincada relação entre ROS celular e morfofunção mitocondrial, ambos idealmente devem ser quantificados simultaneamente em células vivas. Para fazer exatamente isso, um ensaio de imagem de alto conteúdo foi desenvolvido com base em microscopia automatizada de campo amplo e análise de imagem de culturas de células aderentes coradas com as sondas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) e TMRM (mitochondrial Δψ m e morfologia). Imagens de alto conteúdo refere-se à extração de spAtiotemporally ricos ( ou seja , grande número de características descritivas) informações sobre fenótipos celulares usando múltiplos marcadores complementares e análises automatizadas de imagem. Quando combinadas com microscopia automatizada, muitas amostras podem ser rastreadas em paralelo ( isto é, alto rendimento), aumentando assim o poder estatístico do ensaio. Na verdade, um dos principais ativos do protocolo é que permite a quantificação simultânea de vários parâmetros na mesma célula, e isso para um grande número de células e condições.
O protocolo é dividido em 8 partes (descritas em detalhe no protocolo abaixo): 1) Semeadura de células numa placa de 96 poços; 2) Preparação de soluções-mãe, soluções de trabalho e tampão de imagem; 3) Instalação do microscópio; 4) Carregamento das c�ulas com DCFDA CM-H 2 e TMRM; 5) Primeira ronda de imagens ao vivo para medir os níveis basais de ROS e morfofunção mitocondrial; 6) Segunda ronda de imagens ao vivo após adição de terc -butilPeróxido (TBHP) para medir os níveis de ROS induzidos; 7) Análise automatizada de imagens; 8) Análise de Dados, Controle de Qualidade e Visualização.
O ensaio foi originalmente desenvolvido para fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF). Uma vez que estas células são grandes e planas, eles são bem adequados para avaliar a morfologia mitocondrial em 2D widefield imagens [ 13 , 14] . No entanto, com pequenas modificações, este método é aplicável a outros tipos de células aderentes. Além disso, ao lado da combinação de DCFDA CM-H2 e TMRM, o fluxo de trabalho está em conformidade com uma variedade de pares de corantes fluorescentes com diferentes especificidades moleculares 1 , 15 .
Este artigo descreve um método de microscopia de alto conteúdo para a quantificação simultânea de níveis intracelulares de ROS e morfofunção mitocondrial em NHDF. O seu desempenho foi demonstrado com um estudo de caso sobre NHDF tratado com SQV. Os resultados suportam evidências anteriores da literatura em que se observaram níveis elevados de ROS ou disfunção mitocondrial após tratamento com inibidores de protease de HIV tipo 1, embora em experiências separadas 19 , <sup …
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Reagents | |||
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
R version 3.3.2 |