Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi
Summary
Bu makale, hücreye nüfuz eden floresan muhabir molekülleri olan canlı yapışık hücrelerde, mitokondriyal membran potansiyeli ve morfolojisinin yanı sıra mitokondriyal morfofonksiyon olarak da adlandırılan, hücre içi ROS seviyelerinin aynı anda ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi iş akışını sunuyor. 5- (ve- 6) -klorometil-2 ', 7'-diklorodihidrofloresan diasetat, asetil ester (CM-H2 DCFDA) ve tetrametilrhodamin metilester (TMRM).
Abstract
Reaktif oksijen türleri (ROS) gen ekspresyonu, göç, farklılaşma ve proliferasyon da dahil olmak üzere gerekli hücresel süreçleri düzenler. Bununla birlikte, aşırı ROS seviyeleri, DNA'ya, lipitlere ve proteinlere geri döndürülemez oksidatif hasar eşlik eden bir oksidatif stres oluşturur. Böylece, ROS'un nicelendirilmesi, hücresel sağlık durumu için doğrudan bir vekil sağlar. Mitokondri, ROS'un başlıca hücresel kaynakları ve hedefleri arasında yer aldığından, patofizyolojik koşullarda arabağlantıyı daha iyi anlamak için aynı hücrelerde mitokondriyal fonksiyon ve ROS üretiminin ortak analizi önemlidir. Bu nedenle, hücre içi ROS seviyelerinin, mitokondriyal membran potansiyelinin (ΔΨ m ) ve mitokondriyal morfolojinin eşzamanlı olarak nicelendirilmesi için yüksek içerikli mikroskopi tabanlı bir strateji geliştirildi. Çok yönlü plakalarda yetiştirilen, yaşayan adherent hücrelerin otomatik geniş alan floresan mikroskobu ve görüntü analizine dayanıyor ve staineD hücreye geçirgen flüoresan haberci molekülleri CM-H2 DCFDA (ROS) ve TMRM (ΔΨ m ve mitokondriyal morfoloji) ile karşılaştırıldı. Florimetri veya akış-sitometri aksine, bu strateji hem deneysel uyarı öncesi hem de sonrasında, yüksek spatiotemporal çözünürlük ile tek tek hücre seviyesinde subselüler parametrelerin miktarının belirlenmesine izin verir. Önemlisi, yöntemin görüntü temelli doğası, sinyal yoğunluğuna ek olarak morfolojik parametrelerin çıkarılmasına izin verir. Kombine özellik kümesi, alt popülasyonlar, hücre türleri ve / veya tedavileri arasındaki farkları saptamak için araştırma ve istatistiksel çok değişkenli veri analizi için kullanılır. Burada, kimyasal pertürbasyon sonrasında hücresel durumlar arasındaki belirgin ayrımcılık potansiyelini kanıtlayan bir deney deneyiyle birlikte, deneyin ayrıntılı bir tarifi verilmektedir.
Introduction
Hücre içi ROS konsantrasyonu, ROS üreten ve ROS sıyırma sistemleri arasındaki dinamik bir etkileşim vasıtasıyla titizlikle düzenlenir. İkisi arasındaki dengesizlik, oksidatif stres durumunu kışkırtır. ROS'un ana kaynakları arasında mitokondri 1 bulunur . Hücresel solunumda rolleri göz önüne alındığında, hücre içi süperoksit (O 2 • – ) moleküllerinden 2 sorumludurlar. Bu, çoğunlukla elektron nakil zincirinin 1 kompleksinde elektron kaçağından kuvvetli negatif iç mitokondriyal zar potansiyeli (Δψ m ) koşulları, yani mitokondriyal hiperpolarizasyon sonucu ortaya çıkar. Öte yandan, mitokondriyal depolarizasyon, artmış ROS üretimi ile birden fazla etki moduna işaret eden 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Ayrıca, fizyon-füzyon mekanizmalarının proteinlerindeki redoks değişiklikleri ile ROS, mitokondriyal morfolojiyi birlikte düzenlemektedir 9.Farklı mitokondriyum, artmış ROS üretimi ve apoptoz ile korelasyon gösterirken, ipliksi mitokondri, besin yetersizliği ve korunma ile bağlantılıdır Mitofaji 12 . Hücresel ROS ile mitokondriyal morfofonksiyon arasındaki karmaşık ilişki göz önüne alındığında, ikisi de ideal olarak canlı hücrelerde nicelenmesi gerekir. Tam olarak bunu yapmak için, CM-H2 DCFDA (ROS) ve TMRM (mitokondriyal Δψ m ve morfoloji) floresan probları ile lekelenmiş yapışık hücre kültürlerinin otomatik geniş alan mikroskopisi ve görüntü analizine dayanılarak yüksek içerikli bir görüntüleme testi geliştirildi. Yüksek içerikli görüntüleme, sp'ninÇoklu tamamlayıcı işaretleyiciler ve otomatikleştirilmiş görüntü analizi kullanan hücresel fenotipler hakkında atiotemporal bakımdan zengin ( yani çok sayıda açıklayıcı özellik) bilgi. Otomatik mikroskop ile kombine edildiğinde, birçok numune paralel olarak taranabilir ( yani yüksek verimlilik), böylece tahlilin istatistiksel gücünü artırabilir. Aslında, protokolün temel bir öğesi, aynı hücredeki birden çok parametrenin aynı anda sayısallaştırılmasına ve çok sayıdaki hücre ve koşullara göre ayarlanmasına olanak sağlamasıdır.
Protokol 8 bölüme ayrılmıştır (aşağıdaki protokolde ayrıntılı olarak açıklanmıştır): 1) 96 oyuklu plakada hücrelerin tohumlanması; 2) Stok solüsyonlarının, çalışma solüsyonlarının ve görüntü tamponunun hazırlanması; 3) Mikroskop kurulumu; 4) CM-H 2 DCFDA ve TMRM ile hücrelerin yüklenmesi; 5) Bazal ROS düzeylerini ve mitokondriyal morfofonksiyonu ölçmek için ilk canlı görüntüleme yuvarlaklığı; 6) tert -butil ilavesinden sonra ikinci canlı görüntüleme turuIndüklenen ROS düzeylerini ölçmek için peroksit (TBHP); 7) Otomatik görüntü analizi; 8) Veri Analizi, Kalite Kontrolü ve Görselleştirme.
Test orijinal olarak normal insan dermal fibroblastları (NHDF) için geliştirildi. Bu hücreler geniş ve düz olduğundan, 2B geniş alanlı görüntülerde 13 , 14 mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için çok uygundurlar. Bununla birlikte, küçük değişikliklerle bu yöntem, diğer yapışık hücre tipleri için de geçerlidir. Üstelik, CM-H2 DCFDA ve TMRM'nin kombinasyonunun yanında, iş akışı farklı moleküler özgüllükleri olan 1 , 15'e sahip çeşitli floresan boya çiftlerine uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, NHDF'de hücre içi ROS düzeyleri ve mitokondriyal morfofonksiyonun eşzamanlı olarak ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. SQV ile tedavi edilen NHDF üzerine bir vaka çalışmasıyla performansı gösterildi. Sonuçlar, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Materials
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. . shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor–saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- . Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006)
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O’Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O’Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
