लाइट शीट माइक्रोस्कोपी द्वारा फुलमिंटेंट माईकार्डाइटिस के मरीन मॉडल में ल्यूकोसाइट फैलाने का मात्रात्मक विज़ुअलाइज़ेशन
Summary
यहां, हम सीड 745 डीयूटीआर चूहों के इंट्रेट्रेचियल डिप्थीरिया विष उपचार द्वारा प्रेरित सीड 45 + ल्यूकोसाइट फैलाने वाले एसिप्टिक फुलमिनेंट मायोकार्डिटिस के मूरीन मॉडल में एक हल्के शीट माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।
Abstract
लाइट-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम), रासायनिक समाशोधन प्रोटोकॉल के संयोजन में, बड़े जैविक नमूनों में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए स्वर्ण मानक बन गया है, और सेलुलर संकल्प के नीचे है। इस बीच, अंतर्निहित प्रोटोकॉल का निरंतर शोधन और विशेष व्यावसायिक प्रणालियों की बढ़ी हुई उपलब्धता हमें पूरे माउस अंगों के माइक्रोस्ट्रक्चर की जांच करने और विभिन्न लाइव-सेल इमेजिंग दृष्टिकोणों में सेलुलर व्यवहार के लक्षण वर्णन की अनुमति देने में सक्षम बनाता है। यहाँ, हम सूक्ष्म माउस दिलों में CD45 + leukocyte आबादी के स्थानिक पूरे माउंट दृश्य और मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस पद्धति में एक ट्रांसजेनिक माउस तनाव (सीडी 11। डीटीआर) है जो कि हाल ही में घातक घातक मायोकार्डिटिस के विकास के अध्ययन के लिए एक मजबूत, अप्रभावी मॉडल के रूप में काम करने के लिए दिखाया गया है, जो घातक हृदय अतालता द्वारा विशेषता है। इस प्रोटोकॉल में मायोकार्टिटिस प्रेरण शामिल है, अंतर्निहितअल एंटीबॉडी-मध्यस्थता सेल धुंधला हो जाना, अंग तैयारी, और एलएसएफएम के साथ बाद में कंप्यूटर सहायता वाली छवि पोस्ट प्रोसेसिंग। यद्यपि हमारे विशिष्ट वैज्ञानिक प्रश्न के लिए एक उच्च-अनुकूल विधि के रूप में प्रस्तुत किया गया है, प्रोटोकॉल एक आसानी से समायोज्य प्रणाली के खाका का प्रतिनिधित्व करता है जो अन्य अंगों में और यहां तक कि अन्य प्रजातियों में भी पूरी तरह से भिन्न फ्लोरोसेंट संरचनाओं को लक्षित कर सकता है।
Introduction
प्रकाश माइक्रोस्कोपी के विकास के दौरान, कई विशेष रूपों प्रकट हुए, उनमें से सभी विशेष नमूनों के लिए विज़ुअलाइज़ेशन प्रक्रिया में सीमाओं को कम करने के लिए विकसित हुए। ऐसा ही एक तरीका प्रकाश-पत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) है। पहले 1 9 03 में एसडेंटेफ़फ और जेसिगंडी द्वारा विकसित किया गया था और 1 99 0 के प्रारंभ में अपनी पहली मौलिक जैविक अनुप्रयोगों का पता लगाया गया, एलएसएफएम बड़े नमूनों के दृश्य के लिए सबसे शक्तिशाली सूक्ष्म उपकरण बन गया है, जैसे कि अखंड माउस अंग, प्रतिदीप्ति संकेत संकल्प के साथ सेलुलर स्तर तक नीचे इन लाभों के कारण, लाइव-सेल इमेजिंग के लिए अपनी क्षमता के साथ, LSFM नामक प्रकृति विधि "वर्ष 2014 की विधि" 3 ।
जैसा कि नाम से पता चलता है, एक एलएसएफएम में नमूना रोशनी हल्की चादरों द्वारा आयोजित की जाती है, जिसका उपयोग उद्देश्य के अक्ष के लिए लंबवत रूप से केंद्रित होता है।या उत्सर्जन-प्रकाश संग्रह और बाद की छवि संरचना। प्रकाश शीट आम तौर पर एक बेलनाकार लेंस के साथ या संकीर्ण, फ़ोकस वाले लेजर बीम के तेज तरफ आंदोलन द्वारा, एक क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर विमान 4 , 5 में व्यापक, संगोषित लेजर बीम पर ध्यान केंद्रित करके उत्पन्न होता है। इस तरह, इमेजिंग प्रकाशिकी का केवल फोकल प्लेन प्रकाशित होता है, आमतौर पर 1-4 माइक्रोन की मोटाई के साथ। नतीजतन, रोशनी वाले विमान में रखा फ्लोरोसेंट नमूना के लिए, बिखरे हुए प्रकाश की पीढ़ी और फोकल प्लेन के ऊपर या नीचे के क्षेत्रों से फोटोबलीचिंग के प्रभाव को समाप्त कर दिया गया या 6 , 7 को बहुत दबा दिया गया। चूंकि सभी फ़ोकस वाले विमानों को प्रकाशित नहीं किया जाता है, इन क्षेत्रों में फोटोबलीचिंग प्रभाव छोड़े जाते हैं। मानक confocal या बहु-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के विपरीत, प्रबुद्ध और उत्सर्जित प्रकाश के पथ एक दूसरे से अलग होते हैं, इसलिए अंतिम छवि यह उद्देश्य के माध्यम से उत्तेजना प्रकाश किरण के सही ध्यान केंद्रित पर निर्भर नहीं करता है। अंतर्निहित प्रश्न के आधार पर, इसलिए एक विशाल क्षेत्र के दृश्य (एफओवी) के साथ उद्देश्यों का उपयोग करना संभव है ताकि प्रबुद्ध विमान का सबसे बड़ा संभावित क्षेत्र किसी भी घटक भागों के बिना चित्रित किया जा सकता है जो एक्सआई-दिशा में चलते हैं।
आधुनिक एलएसएफएम प्रणालियों में, उत्पन्न ऑप्टिकल अनुभाग की एक फ्लोरोसेंट छवि को एक अति संवेदनशील चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) या पूरक धातु-ऑक्साइड अर्धचालक (सीएमओएस) कैमरों पर कब्जा कर लिया जाता है, जो संपूर्ण क्षेत्र दृश्य (एफओवी) हासिल करने में सक्षम होते हैं। माइक्रोसॉन्ड्स में इसलिए, नमूना को प्रकाश शीट के माध्यम से ले जाकर और परिभाषित z- चरणों में छवियों को प्राप्त करके, उचित समय 8 , 9 में एक नमूने की पूरी 3 डी जानकारी प्राप्त करना संभव है, इस तकनीक को लाइव-सेल पढ़ाई 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12
फिर भी, हालांकि, एलएसएफएम तेजी से, संवेदनशील और प्रतिदीप्ति-अनुकूल तरीके प्रदान करता है, नमूना के माध्यम से प्रकाश संचरण अभी भी एक प्रमुख मुद्दा है, खासकर जब बड़े जैविक नमूने एक 3D विश्लेषण के लिए लक्ष्य हैं हल्के संचरण को अवशोषण के भौतिक पहलुओं और अलग-अलग अपवर्तक सूचकांकों के साथ संरचनाओं के इंटरफेस पर प्रकाश बिखरने से गंभीर रूप से संशोधित किया गया है। इसलिए, जब इमेजिंग नमूने आकार में कई मिलीमीटर, एलएसएफएम को ऑप्टिकली पारदर्शी नमूनों को प्रस्तुत करने के लिए ज्यादातर क्लियरिंग प्रोटोकॉल के साथ मिलाया जाता है। इन तकनीकों को संबंधित जैविक ऊतकों से पानी निकालने और इसे जल या (कार्बनिक) विलायक आधारित विसर्जन मीडिया के साथ आदान प्रदान करने के विचार पर आधारित हैं, जो विशेष लक्ष्य टिशू घटकों के अपवर्तक सूचकांकों से बाल निकालने के लिए चुना जाता है। नतीजतन, पार्श्व प्रकाश बिखरने को कम किया जाता है, और सभी तरंग दैर्ध्यप्रकाश की अधिकतापूर्वक ऊतक 13 से गुजर सकती है कई मामलों में, इस तरह से किए गए जैविक नमूने मैक्रोस्कोपिक रूप से क्रिस्टल-स्पष्ट दिखाई देते हैं, जो एलएसएफएम को लंबे समय तक काम-दूरी, कम बढ़ाई उद्देश्यों का उपयोग करते हुए पूरे माउस अंगों पर भी संचालित करने में सक्षम बनाता है।
यहां, हम एक हल्के शीट माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका देखें) में बड़ी-नमूना इमेजिंग के लिए एक तैयारी प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जिसे हमने म्यूकार्डिटिस 15 के मूवीन मॉडल में सेलुलर कार्डियाक की घुसपैठ की जांच करने के लिए स्थापित किया है। CD11c.DTR चूहों सीडी 11 सी प्रमोटर 16 के नियंत्रण में प्राइमेट डिप्थीरिया टोक्सिन रिसेप्टर (डीटीआर) को व्यक्त करते हैं। नतीजतन, इन चूहों में कोशिकाओं, जो सीडी 11 सी को डीटीआर के साथ व्यक्त करते हैं, कोरीनेबैक्टीरियम डिप्थेरिया (डिप्थीरिया विष, डीटीएक्स) के एक्सोटॉक्सिन के प्रति संवेदनशील होते हैं ; डीटीएक्स के साथ इन जानवरों का सिस्टमिक उपचार सभी सीडी 11 सी + सीई की कमी के कारण होता हैlls। सीडी 11 सी एक इंटीग्रिन है और विभिन्न घुलनशील कारकों के लिए एक सेल-स्पेस रिसेप्टर के रूप में सक्रियता और परिपक्वता प्रक्रियाओं में मुख्यतः मोनोसाइटिक वंश 17 की कोशिकाओं में शामिल है। नतीजतन, सीडी 11। डीटीआर माउस मॉडल को कई अलग-अलग इम्युनोलॉजिकल सवालों के संदर्भ में वृक्ष के समान कोशिकाओं और मैक्रोफेज सबसेट्स की भूमिका का अध्ययन करने के लिए तीव्रता से उपयोग किया गया है। समय के साथ, यह सूचित किया गया है कि डीडीएक्स के साथ प्रणालीगत इलाज के लिए CD11c.DTR चूहों प्रतिकूल दुष्प्रभाव पैदा कर सकता है और जोरदार ऊंचा मृत्यु दर 18 , 1 9 प्रदर्शित कर सकता है। हाल ही में, हम इन जानवरों में इंट्रेट्रेचियल डीटीएक्स आवेदन के बाद फायरमिनेंट मायोकार्टिटिस के विकास का वर्णन करते हुए मौत 15 के मूल कारण की पहचान करने में सक्षम थे। विष चुनौती दिल में उत्तेजना संचरण प्रणाली के केंद्रीय भागों सहित, सेलुलर विनाश का कारण था। यह बड़े CD45 के साथ था+ लुकासैट घुसपैठ, अंत में घातक हृदय अतालता के लिए अग्रणी इस मामले में, न केवल ल्यूकोसैट जनसंख्या की उपस्थिति महत्वपूर्ण थी, बल्कि दिल के भीतर इसके स्थानिक वितरण भी था। यह प्रयोगात्मक प्रश्न आधुनिक माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग के लिए एक चुनौती है, जिसे हमने एक हल्के शीट माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण से हल किया है जो इंट्राविलेट एंटीबॉडी धुंधला और एक कार्बनिक विलायक-आधारित ऑप्टिकल क्लियरिंग प्रोटोकॉल द्वारा समर्थित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आधुनिक जीवन विज्ञान में, जैविक प्रक्रियाओं की सूक्ष्म दृश्यता एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इस संदर्भ में, पिछले दो शताब्दियों के दौरान कई घटनाएं प्राप्त हुई हैं, जो इस बिंदु तक संबोधित नहीं किए गए ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
गन्ज़र प्रयोगशाला में रिसर्च जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री ऑफ़ एजुकेशन एंड रिसर्च (अनुदान नंबर 0315590 एडी) और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (अनुदान नंबर GU769 / 4-1, GU769 / 4-2) द्वारा समर्थित था। हम 3 डी कार्टून मॉडलिंग के साथ तकनीकी सहायता और सेबेस्टियन क्यूबैट के लिए आईएमसीईएस का आभार व्यक्त करते हैं।
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
