Summary

3D空間の細胞培養のための細胞骨格などの生体適合性液晶エラストマー発泡体の合成

Published: April 11, 2017
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Summary

この研究は、3D、生体適合性の側鎖型液晶エラストマー(種の保存法)に基づいて、生分解性、泡様細胞の足場を調製するための方法論を提示します。共焦点顕微鏡実験は泡状種の保存法は、細胞の付着、増殖、およびC2C12s筋芽細胞の自発的なアライメントを可能にすることを示しています。

Abstract

ここでは、3D、生分解性、泡様細胞足場のステップバイステップの準備を提示します。これらの足場は、スメクチックA(SMA)、液晶エラストマー(種の保存法)で得られた、側鎖のペンダント基としてコレステロールユニットを搭載星型ブロックコポリマーを架橋することによって調製しました。泡のような足場は、3D細胞培養足場、それらに適したものに、金属テンプレートを用いて調製し、相互接続さマイクロチャネルを備えています。従来の多孔質テンプレートフィルムと比較するだけでなく、より高い細胞増殖を促進する三次元細胞骨格における金属発泡体の規則的な構造のエラストマー結果の組み合わせの特性だけでなく、大量輸送のより良い管理( すなわち、栄養物、ガス、廃棄物、 など )。金属テンプレートの性質は、泡の形状( すなわち、ロールまたはフィルム)の容易な操作を可能にし、異なる細胞研究のための異なる孔径の足場の調製のためのinterconnecを維持しながら、テンプレートのテッド多孔性の性質。エッチングプロセスは、その生体適合性および生分解性を維持したまま、エラストマーの化学的性質に影響を与えることはありません。私たちは、細胞の成長と増殖を促進しながら、これらのスメクティック種の保存法は、広範囲の期間のために増殖させた場合、臨床的に関連して、複雑な組織構築物の研究を可能にすることを示しています。

Introduction

細胞研究において、細胞の付着および増殖を1、2、3、4、5を目指し組織再生のためのアプリケーションのために設計された生物学的および生体適合性合成材料のいくつかの例があります。 6、 図7を注文分子異方性の外部刺激に応答することができ、液晶エラストマー(種の保存法)として知られている生体適合性材料のいくつかの例、、がありました。種の保存法は、光学機能と液晶8,9の分子秩序を有するエラストマーの機械的および弾性特性を組み合わせた刺激応答性物質です。種の保存法外部STIMに応じて形状、機械的変形、弾性挙動、および光学的性質の変化を体験することができULI( すなわち 熱、応力、光、 )10、11、12、13、14、15、16。以前の研究では、液晶(LCS)がセル4、17の成長と配向を感知することができることを示しています。これは種の保存法が細胞の足場とアラインメントを含む、生物学的および医学的に関連する用途に好適であり得ると仮定することが可能です。我々は以前、「スイスチーズの種類」、多孔質の形態6、18搭載スメクティック生体適合性、生分解性、キャスト成形、および薄い種の保存法フィルムの作製を報告しています。我々はまた、細胞増殖19 <ための足場として球状形態を有するネマチック生体適合性種の保存法調製しますSUP>、20。私たちの仕事は、関心21の組織のものと一致する材料の機械的特性を調整することを目的としています。また、これらの研究は、エラストマー – 細胞相互作用、ならびにエラストマーは外部刺激の対象となる細胞応答を理解することに焦点を当てます。

主な課題は、エラストマーマトリックスを介してより良い大量輸送のための細胞の付着および浸透を可能にするために、種の保存法の気孔率を調整する部分でした。これらの薄膜6の気孔率は、マトリックスのバルクを通って細胞透過性のために許可され、すべてではない孔が完全に相互接続されたまたは孔(均質)よりレギュラーサイズを有していました。私たちは、その後、球状の形態を有する生体適合性ネマチックLCEエラストマーについて報告しました。これらネマチックエラストマーは、付着および細胞の増殖を許容するが、細孔サイズが防止10-30ミクロンからのみ範囲又はこれらの使用を制限し細胞株19,20の広い様々なエラストマー。

クンの前の仕事 「犠牲」金属テンプレートを使用してグラフェン発泡体の形成に関連して得られたグラフェンフォームが選択された金属テンプレート22によって決定非常に規則的な多孔性の形態を有することを示しました。この方法では、気孔率及び気孔サイズの完全な制御を提供しています。同時に、金属テンプレートの可鍛性と柔軟性は、前のフォームの準備に異なるテンプレート形状の形成を可能にします。いくつかのケースでは、細孔サイズは、限定され、そのような材料の浸出23、ガステンプレート24、または電気紡糸繊維25、26のような他の技術は、また、多孔性材料の調製のための可能性を提供するが、それらはより多くの時間がかかるとされていますわずか数メートル。フォーム3D種の保存法様金属テンプレートは、より高いセル負荷を可能に用いて調製。改善された増殖速度。共培養;そして、、少なくとも最後のではなく、より良い大量輸送管理( すなわち 、栄養素、ガス、及び廃棄物)の完全な組織開発27を確保します。泡状3D種の保存法は、細胞整列を改善するように見えます。これは、細胞増殖と細胞の向きを検知するLCのペンダントとの関係で最も可能性が高いです。 LCE内のLC部分の存在は、LCE足場内の細胞の位置に対する細胞配向性を高めるように見えます。支柱は、一緒に(接合部)27の参加ここでは明確な配向が観察されないながら細胞は、LCEの支柱内に整列させます。

全体として、細胞支持体としてのLCE細胞足場プラットフォームを調整するために、エラストマーの形態と弾性特性、特にO順序付けられた、空間的配置を作成する(個々の)細胞型の位置合わせを指示するの機会を提供します生体系に似てF細胞。別に維持および長期細胞成長および増殖を指示することができる足場を提供することから、種の保存法はまた、細胞の配向との相互作用をオンザフライで修正することができる動的な実験を可能にします。

Protocol

注記:3アームスターブロック共重合体を用いた3D LCE泡状調製のための以下のステップは、 図1に示されています。核磁気共鳴(NMR)特性決定のために、スペクトルは、Bruker DMX 400 MHz装置で室温で重水素化クロロホルム(CDCl 3中)に記録されており、内部7.26の残留ピークを参照します。フーリエ変換赤外(FT-IR)スペクトルを変換する減衰全反射モードを用いたB…

Representative Results

このレポートは、ニッケル金属テンプレートを使用して、細胞培養のための足場としての多孔質の3D LCEの調製方法を示します。得られた3D LCEは容易細胞浸潤を可能にする複雑な相互接続チャネルネットワーク、ならびにより適切な物質移動27を示しています。これは、細胞が完全に相互接続チャネルネットワークに侵入することができ、また、LCE内?…

Discussion

液晶エラストマーは、最近、それらの刺激応答性、生体適合性細胞の足場として研究されてきました。彼らは、細胞の足場として理想的なプラットフォームであることが証明されています。しかし、新しいLCE足場を準備して設計する際に心に留めておくべき重要な要因は、多孔性です。浸出性固形物23またはガスの取り込みは、常に均質な多孔性または完全に相互接続され?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロジェクトの財政支援のために – 著者はケント州立大学(ReMedIKSケント州での再生医療・イニシアティブのための共同研究助成金や支援を)感謝したいと思います。

Materials

1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane Alfa Aesar L16606 Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane TCI B0928 Reagent
2-chlorohexanone  Alfa Aesar A18613 Reagent
2-heptanone  Sigma Aldrich W254401 Solvent
2-propanol  Sigma Aldrich 278475 Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA Sigma Aldrich 273031 Reagent
4-dimethylaminopyridine Alfa Aesar A13016 Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI  Invitrogen D1306 Nuclear Stain
5-hexynoic acid  Alfa Aesar B25132-06 Reagent
Acetic acid VWR 36289 Solvent
Acetone Sigma Aldrich 34850 Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade  VWR 71001-866 Reagent
Benzene Alfa Aesar AA33290 Solvent
ε-caprolactone  Alfa Aesar A10299-0E Reagent
Chloroform VWR BDH1109 Solvent
Cholesterol Sigma Aldrich C8503 Reagent
Chromium(VI) oxide Sigma Aldrich 232653 Reagent
Copper (I) iodide Strem Chemicals 100211-060 Reagent
D,L-Lactide  Alfa Aesar L09026 Reagent
Dichloromethane Sigma Aldrich 320269 Solvent
Diethyl ether  Emd Millipore EX0190 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME  CORNING Cellgo 10-013 Cell Media
Ethanol Alfa Aesar 33361 Solvent
Formaldehyde  SIGMA Life Science F8775 Fixative
Fetal bovine serum, FBS  HyClone SH30071.01 Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe VWR 28320 Filtration
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI Sigma Aldrich 52649 Crosslinker
Iron(III) chloride  Alfa Aesar 12357 Etching agent
Isopropyl alcohol VWR BDH1133 Solvent
Methanol Alfa Aesar L13255 Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Aldrich D80002 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Nickel metal template American Elements Ni-860 Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) ATCC CRL-2266 Cell line
Penicillin streptomycin  Thermo SCIENTIFIC 15140122 Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG Alfa Aesar B22181 Reagent
Sodium azide  VWR 97064-646 Reagent
Sodium bicarbonate AMRESCO 865 Drying salt
Sodium chloride BDH BDH9286 Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S-374 Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma Aldrich S9638 Drying salt
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313 Drying salt
Tetrahydrofuran Alfa Aesar 41819 Solvent
Thiosulfate de sodium AMRESCO 393 Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate Aldrich S3252 Reagent
Toluene  Alfa Aesar 22903 Solvent
Triethylamine Sigma Aldrich 471283 Reagent
Trypsin  HyClone SH30042.01 Cell Detachment
Olympus FV1000

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Prévôt, M. E., Ustunel, S., Bergquist, L. E., Cukelj, R., Gao, Y., Mori, T., Pauline, L., Clements, R. J., Hegmann, E. Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (122), e55452, doi:10.3791/55452 (2017).

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