Summary

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em> Mycobacterium tuberculosis</em

Published: March 24, 2017
doi:

Summary

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Abstract

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

Introduction

Tüberküloz (TB) 40 yılı aşkın 1 TBC kemoterapi rejimlerinin varlığına rağmen ciddi bir küresel sağlık tehdidi olmaya devam etmektedir. Bu uyumsuzluğu 2 hastaya neden çoklu ilaç kombinasyonları kullanılarak 6 aydan uzun tedavi dönemleri için gereksinimi, kısmen kaynaklanmaktadır. Klinik onaylı ilaçların başarılı gelişimi 3 neredeyse varolmayan olduğu son yıllarda ilaca dirençli TB çıkması ayrıca bir alanda sorunları bileşik etti. Nitekim, ayrıntılı bir anti-TB ilaç geliştirme rağmen, sadece tek bir ilaç FDA son 40 yılda 4 klinik kullanım için onaylanmıştır olmuştur. Bu nedenle, anti-TB ilaçların yeni nesil acilen bu sorunu çözmek için ihtiyaç vardır.

TB ilaç keşfinde önemli bir sorun klinik ortamda etkinliğine in vitro aktiviteye sahip bileşikler başarılı transfer olmaması= "xref"> 5, 6, 7. Başlangıçta, hedef bazlı yaklaşımlar tam bakteriyel hücrelere çevirmek için başarısız anti-Mtb Drugs 5, taranması için kullanıldı. Mtb hücreleri kullanılır bile, genellikle doğru vivo 8, 9 ilaç etkinliğini öngörmek olmayan suyu üreyen kültürler, kullanılarak gerçekleştirilir. Bu sorunlar, tanınmış ve MTB veya gizli Mtb içeren makrofajlar karşı ilaç tarama deneyleri başarıyla 8, 10, 11, 12 tespit edilmiştir. Ancak, hatta bu daha gelişmiş analizler ilaçlar non-vaskülarize akciğer lezyonları karşılaştıkları penetrasyon engelleri yeterli önem vermesi ve yok enfeksiyon yerinde nekrotik odaklar. AslındaHatta ilk basamak TB ilaç rifampisin için, sub-optimal doz nedeniyle in vivo doku ve beyin omurilik sıvısı (BOS) 'de vasat sorgulanmıştır hücre içi Mtb 8, 9 karşı etkinin azalmasına yanı sıra 13, 14, 15 nüfuz. şüphesiz TB ilaç keşif çabalarını artıracak erken kurşun geliştirme sürecinde dikkate bu parametreleri alacak gibi, yeni modeller ve tahlilleri gibi.

Bu ihtiyacı karşılamak için, biz son zamanlarda Mtb ilaç etkinlik testleri 16 için, ucuz, hızlı ve BSL-2 uyumlu alternatif enfeksiyon modeli kurdu. Fizyolojik ilgili hücresel penetrasyon engelleri değinmeyecek ve makrofaj pasajlandı oluşturulan yoğun üretilen büyük makrofaj agrega yapılar içinde Mtb paketlenmiş Bu enfeksiyon modeli, <em> gizli Mtb benzeyen değiştirilmiş bir fizyolojik durum ile Mtb. Bu enfeksiyon modeli türetilmiş Mtb diğer hücre içi enfeksiyon modellerinde tutarlı sonuçlar ilaç etkinliğini değerlendirmek için resazurin mikrotiter tahlilde (REMA) ile birleştirildi ve serum konsantrasyonlarına kıyasla yüksek CSF konsantrasyonlarının elde edilmesi için ortak bir TBC ilaç bildirilen yeteneği ile de korelasyon 16.

Burada ayrıntılı olarak rema kullanılarak ilaç duyarlılık testi için makrofaj geçirilmiş Mtb uygun üretmek Mtb / makrofaj agrega yapıların üretilmesini tarif eder. Özel olarak, bu enfeksiyonun sistemi aday anti-TBC ilaçların verimli tarama ile uyumlu bir 96-gözlü formata adapte olabilir şeklini göstermektedir.

Protocol

NOT: 2 6206 bir avirulent suşu 17, 18 M. tuberculosis mc gibi, bu protokoldeki tüm çalışma Biyogüvenlik Seviye 2 tesis (BSL-2) yapılabilir. M. tuberculosis mc 2 ifade Yeşil Floresan Protein 1. Kültür koşulları 6206 (Mtb GFP) NOT: M. tuberculosis H37Rv auxotroph suşu 6206 mc 2 türetilmiş (Δ panCD, Δ leuCD)…

Representative Results

96 gözlü plaka formatında bu enfeksiyon modeli uyarlamak sağlamlığını teyit etmek için, burada Şekil verilen şablona göre bir ilaç eden 96 oyuklu türetilen Mtb duyarlılığını enfeksiyonu rifampisin modeli (RIF) ve moksifloksasin (Moxi) adapte incelenmiştir 1 A. Bu deneyde anahtarı Mtb / makrofaj agrega yapıların üretimi güvenilir bir şekilde ve böylece verim uyumluluğu (Şekil 1B) sağlayarak,…

Discussion

Burada, ayrıntılı olarak ilaç etkinlik testleri için uygun bir alternatif Mtb enfeksiyonu modeli tarif var. Bu model hesabına erken TB ilaç geliştirme sürecinde daha fazla dikkate alınmalıdır iki önemli faktör dikkate alır: ilaç penetrasyonu ve enfeksiyon sırasında Mtb metabolik değişikliklere fizyolojik ilgili engellerin varlığı. Daha önce bizim enfeksiyon modelinin yararları gösterilmiştir ve verimlilik uyumluluğu 16 enfeksiyon ölçekleme olasılı…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.

Materials

7H9 BD Difco 271310 Follow manufacturer's recommendations
Middlebrook OADC BD Biosciences 212351
Tyloxapol Sigma T8761 Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma P5710 Prepare 24 mg/ml  stock solution in H2O; filter sterilize
L-leucine MP Biomedicals 194694 Prepare 50 mg/ml  stock solution in H2O; filter sterilize
Hygromycin B EMD Millipore 400051 Prepare 200 mg/ml  stock solution in H2O
Nalgene Square PETG media bottle Thermo Fisher 2019-0030
RPMI 1640 media Hyclone SH30027.01
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S12450H
L-glutamine Corning MT25005CI
HEPES Hyclone SH30237.01
Cytation 3 plate reader Biotek Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope
Gen5 Software Biotek Recording and analysis of rezasurin coversion
Rifampicin  Fisher Scientific BP2679250 Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O
Moxifloxacin Hydrochloride Acros Organics 457960010 Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O
Resazurin Sodium Salt Sigma R7017 Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
Tween-80 Fisher Scientific T164500 Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize

References

  1. Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
  2. Bass, J. B., et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
  3. Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
  4. Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
  5. Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
  6. Evangelopoulos, D., Fonseca, d. a., D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
  7. Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
  8. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
  9. Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
  10. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
  11. Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
  12. Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
  13. Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?. Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
  14. van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?. Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
  15. Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
  16. Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
  17. Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
  18. Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
  19. Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
  20. Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
  21. Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).

Play Video

Cite This Article
Schaaf, K., Smith, S. R., Hayley, V., Kutsch, O., Sun, J. A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (121), e55453, doi:10.3791/55453 (2017).

View Video