배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동
Summary
여기, 우리는 침략 행위를 조사하고 각각 인간의 유방암 세포의 intravasation 및 혈관 외 유출 가능성을 평가하기 위해, 두 개의 서로 다른 주사 부위, 즉, 난황 주위 공간과 퀴비에의 덕트를 사용하여 이종 이식 제브라 피쉬 모델을 설명합니다.
Abstract
대부분의 경우, 암 환자는 오히려 때문에 전이, 차 종양으로 사망하지 않습니다. 수많은 설치류 모델은 생체 내에서 암 전이를 공부 할 수 있지만, 다른 효율, 신뢰성, 저가의 모델은 신속하게 (에피) 유전 변경 또는 약리 화합물의 잠재적 인 효과에 액세스하는 데 필요합니다. 따라서, 우리는 설명하고이 목표를 지원하기 위해 제브라 피쉬 배아에 주입 인간의 유방암 세포를 이용한 이종 이식 모델의 타당성을 설명합니다. 현미경, 형광 단백질 또는 화학적 표지 된 인간 유방암 세포를 형질 전환 지브라 피쉬 수정란에 이식되고, Tg는 (FLI : EGFP), 48 시간 수정 후의 난황 주위 공간 또는 퀴비에 (독)의 덕트로. 그 직후, 살아있는 물고기의 몸에 암 세포 침공, 보급 및 전이의 시간적 공간적 과정은 형광 현미경으로 시각화됩니다. 즉, 서로 다른 주사 부위를 사용하여 모델, 당ivitelline 공간 또는 문서는 초기 (intravasation 공정) 및 후기 이벤트 전이성 다단계 캐스케이드 (넘쳐 공정)을 반영하여 서로 상호 보완 적이다. 또한 peritumoral 및 종양 혈관 신생 난황 주위 공간으로 주입하여 관찰 할 수있다. 전체 실험 기간은 더 이상 팔일 이상 없습니다. 이 두 모델은 유전 및 약리 조작에 대한 응답으로 암 전이의 신속한 평가를 가능하게 셀 라벨, 마이크로 이식, 형광 이미징 기술을 결합한다.
Introduction
병원에서 명백한 암 전이는 "전이성 폭포"로 알려진 복잡하고 여러 단계의 일련의 사건을 포함한다. 캐스케이드는 광범위하게 검토하고 연속적인 단계로 해부 할 수 있습니다 : 지역 침공, intravasation, 보급, 체포, 넘쳐, 그리고 식민 1, 2. 암 전이의 기전 및 생체 내에서 잠재적 인 치료 전략의 개발의 더 나은 이해는 암 세포 확산의 강력한 호스트 모델을 필요로한다. 설치류 모델은 잘 확립되어 널리 전이 3을 평가하는 데 사용되지만, 이러한 접근 방식은 낮은 효율성과 윤리적 한계를 가지고 특정 조작이 전이성 표현형에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하기 위해 최전선 모델로 비용이 많이 든다. 다른 효율, 신뢰성, 저가의 모델은 신속하게 (에피) 유전 적 변화 나 pharmacolog의 잠재적 영향에 액세스하는 데 필요한iCal의 화합물. 때문에 높은 유전 적 인간 상동과 배아의 제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio))의 투명성에 중요한 척추 모델로 등장하고 점점 발달 과정, 미생물 – 호스트 상호 작용, 인간의 질병, 약물 검사 등의 연구에 적용되고 . 사. 제브라 피쉬 년에 설립 된 암 전이 모델은 설치류 모델 5, 6의 단점에 대한 답변을 제공 할 수 있습니다.
자연 종양이 거의 야생 제브라 피쉬 7에서 본 적이 있지만, 제브라 피쉬에서 원하는 암을 유발하는 여러 가지의 오랜 기술이있다. 발암 성 물질에 의한 유전자 돌연변이 또는 신호 전달 경로의 활성화는 조직 학적 및 분자 모델 발암, 제브라 피쉬 7, 8, 9, 인간의 질병을 모방 할 수 있습니다. 탁으로암 유전자 또는 종양 억제 유전자 조작을 앞으로 다양한 활용을 보내고 및 역방향 (유전자 변형) 제브라 피쉬는 암의 형성과 유지 보수 (6), (10)의 잠재적 인 연구를 활성화. 제브라 피쉬 유도 암 모델 소화, 생식, 혈액, 신경계, 6 상피 세포를 포함하는 광범위한 스펙트럼을 커버한다.
암 연구에 제브라 피쉬의 사용으로 인해이 유기체 인간 종양 세포의 이종 이식 모델의 설립에 최근에 확장했다. 이 작업은 처음 성공적으로 2005 (11)의 포배 단계에서 제브라 피쉬 배아에 접목 된 인간의 전이성 흑색 종 세포로보고되었다. 여러 독립적 인 실험실은 다양한 사이트 및 발달 단계에서 제브라 피쉬으로 포유 동물의 암 세포 라인의 다양한 범위를 도입하여이 선구적인 작업의 타당성을 검증 한 5 </ SUP>. 예를 들어, 상기 blastodisc 포배 단계의 배반포 근처 주사; 5 일 된 배아 난황낭, 난황 주위 공간 퀴비에 (독)의 덕트, 6-H-의 후방 기수 정맥 주사; 30 일된 면역 애벌레의 복강에 주사 12 5 수행되었다. 또한, 동종 종양 이식은 제브라 피쉬 (12), (13)에보고되었다. 이종 이식을 사용의 가장 큰 장점 중 하나는 접목 암 세포가 쉽게 형광 표지와 정상 세포를 구별 할 수 있다는 것입니다. 따라서, 14 microtumor 형성 세포 침윤 및 전이 15, 16, 17, 종양 – 유도 된 혈관 형성 (15), (1)의 동적 거동에 조사8, 암 세포와 호스트 사이의 상호 작용은 형질 전환 제브라 피쉬 라인 5를 적용 특히, 17 분명히 활어 몸으로 시각화 할 수 있습니다 요인.
문서 주사 (16)을 통해 제브라 피쉬 배아 : 전이를 평가하기 위해 제브라 피쉬 이종 이식 모델의 높은 잠재력에 의해 영감을, 우리의 Tg (EGFP FLI)의 tailfin 영역에 다른 유방암 세포 라인의 transvascular 혈관 외 유출 특성을 보여 주었다. 성장 인자 β (TGF-β) (16)과 뼈 형태 형성 단백질 변형의 역할은 (BMP)을 / 프로 안티 – 유방암 세포 침윤과 전이 19 신호 전달 경로도이 모델에서 조사 하였다. 또한, 우리는 또한 난황 주위 공간 주사와 이종 이식 제브라 피쉬 모델을 사용하여 혈액 순환에 다양한 유방암 세포주의 intravasation 능력을 효과적으로 요약.
<p class = "jove_content는">이 문서에서는 난황 주위 공간 또는 문서에 인간의 유방암 세포의 주입에 따라 제브라 피쉬의 이종 이식 모델에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 고해상도 형광 이미징을 사용하여, 우리는 혈관에 intravasation와 무 혈관 tailfin 영역으로 혈관에서 이동 다른 인간의 유방암 세포의 침략 행위를 대표하는 과정을 보여줍니다.Protocol
Representative Results
Discussion
난황 주위 공간과 문서와 주사 피쉬 배아 : 여기서는의 Tg (EGFP fli1) 유방암 세포의 침입 문제를 조사하기 위해 두 가지 방법을 설명했다. 형질 전환 지브라 피쉬 배아에 화학 염료 또는 형광 단백질 표지 암세포를 주입하여, 침윤 및 전이의 동적 및 공간 특성이 명확하게 형광 현미경 하에서 단일 셀 또는 클러스터 레벨에서 실시간으로 추적 될 수있다. 대부분의 경우, 제브라 피쉬의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TGF-β 가족 구성원에 대한 연구는 암 유전체학 센터 네덜란드에서 지원됩니다. 시지아 리우와 장 르네는 라이덴 대학에서 공부 4 년 동안 중국 장학위원회에 의해 지원됩니다. 우리는 MCF10A 세포 라인 박사 프레드 밀러 (바바라 앤 Karmanos 암 연구소, 디트로이트, MI, USA)을 감사드립니다.
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
