भ्रूणीय Zebrafish में मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं के आक्रामक व्यवहार
Summary
यहाँ, हम दो अलग-अलग इंजेक्शन साइटों, यानी, perivitelline अंतरिक्ष और कुवियर की वाहिनी का उपयोग कर, आक्रामक व्यवहार की जांच के लिए और मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं की intravasation और तरल पदार्थ का स्त्राव संभावित आकलन करने के लिए क्रमश: जेनोग्राफ्ट zebrafish मॉडल का वर्णन।
Abstract
कई मामलों में, कैंसर रोगियों एक प्राथमिक ट्यूमर के मर जाते हैं, बल्कि मेटास्टेसिस की वजह से। हालांकि कई कृंतक मॉडल विवो में कैंसर मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए उपलब्ध हैं, अन्य कुशल, विश्वसनीय, कम लागत वाली मॉडल जल्दी से (एपि) आनुवंशिक परिवर्तन या औषधीय यौगिकों के संभावित प्रभावों का उपयोग करने की जरूरत है। जैसे, हम उदाहरण देकर स्पष्ट करना और मानव स्तन कैंसर zebrafish भ्रूण में इंजेक्ट इस लक्ष्य को समर्थन करने के लिए कोशिकाओं का उपयोग कर जेनोग्राफ्ट मॉडल की व्यवहार्यता की व्याख्या। माइक्रोस्कोप के तहत, फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रासायनिक लेबल मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं ट्रांसजेनिक zebrafish भ्रूण में प्रत्यारोपित कर रहे हैं, टीजी (fli: EGFP), perivitelline अंतरिक्ष या Cuvier (डॉक्टर) की वाहिनी 48 ज निषेचन के बाद में। शीघ्र ही बाद में, कैंसर कोशिका आक्रमण, प्रसार, और रहने वाले मछली शरीर में मेटास्टेसिस के अस्थायी स्थानिक प्रक्रिया एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कल्पना है। अलग इंजेक्शन साइटों, यानी का उपयोग कर मॉडल, प्रतिivitelline अंतरिक्ष या डॉक्टर एक-दूसरे के पूरक हैं, प्रारंभिक चरण (intravasation कदम) और अंतिम चरण की घटनाओं की multistep मेटास्टेटिक झरना (परिस्त्राव कदम) को दर्शाती है। इसके अलावा, peritumoral और intratumoral एंजियोजिनेसिस perivitelline अंतरिक्ष में इंजेक्शन के साथ मनाया जा सकता है। पूरे प्रयोगात्मक अवधि 8 दिन से अधिक नहीं है। इन दो मॉडल, सेल लेबलिंग, सूक्ष्म प्रत्यारोपण, और प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक गठबंधन आनुवंशिक और औषधीय जोड़तोड़ के जवाब में कैंसर मेटास्टेसिस के तेजी से मूल्यांकन सक्षम करने से।
Introduction
क्लिनिक में प्रकट कैंसर मेटास्टेसिस "मेटास्टेटिक झरना" के रूप में जाना जटिल और बहु-चरण घटनाओं की एक श्रृंखला शामिल है। झरना बड़े पैमाने पर समीक्षा की गई है और लगातार चरणों में विच्छेदित किया जा सकता है: स्थानीय आक्रमण, intravasation, प्रसार, गिरफ्तारी, तरल पदार्थ का स्त्राव, और उपनिवेशन 1, 2। कैंसर मेटास्टेसिस के रोगजनन और विवो में संभावित उपचार रणनीतियों के विकास का एक बेहतर समझ कैंसर कोशिका प्रसार की मजबूत मेजबान मॉडल की आवश्यकता है। कृंतक मॉडल अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं और व्यापक रूप से मेटास्टेसिस 3 मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन इन तरीकों कम दक्षता और नैतिक सीमाएं हैं और एक मामले में सबसे आगे मॉडल निर्धारित करने के लिए एक विशेष हेरफेर मेटास्टेटिक फेनोटाइप को प्रभावित कर सकता है कि क्या के रूप में महंगा है। अन्य कुशल, विश्वसनीय, कम लागत वाली मॉडल जल्दी से (एपि) आनुवंशिक परिवर्तन या Pharmacolog के संभावित प्रभावों का उपयोग करने की जरूरत हैiCal यौगिकों। मनुष्य के लिए अपने उच्च आनुवंशिक अनुरूपता और उनके भ्रूण zebrafish (Danio rerio) की पारदर्शिता के कारण एक महत्वपूर्ण हड्डीवाला मॉडल के रूप में उभरा है और तेजी से विकास प्रक्रियाओं, सूक्ष्म जीव मेजबान बातचीत, मानव रोगों, दवा स्क्रीनिंग, आदि के अध्ययन के लिए लागू किया जा रहा । 4। कैंसर मेटास्टेसिस zebrafish में स्थापित मॉडल कृंतक मॉडल 5, 6 की कमियों का उत्तर दे सकते हैं।
हालांकि सहज रसौली शायद ही जंगली zebrafish 7 में देखा जाता है, वहाँ zebrafish में वांछित कैंसर प्रेरित करने के लिए कई लम्बे समय से की तकनीक है। कैसरजन-प्रेरित जीन म्यूटेशन या संकेतन मार्ग सक्रियण Histologically और molecularly मॉडल कैंसरजनन, zebrafish 7, 8, 9 में मानव रोग नकल उतार सकते हैं। तक तकविविध का लाभ ing आगे और ओंकोजीन या ट्यूमर शामक की आनुवंशिक जोड़तोड़ रिवर्स (ट्रांसजेनिक) zebrafish भी कैंसर के गठन और रखरखाव 6, 10 की क्षमता के अध्ययन सक्षम है। Zebrafish में प्रेरित कैंसर मॉडल पाचन, प्रजनन, रक्त, तंत्रिका तंत्र, और उपकला 6 सहित एक व्यापक स्पेक्ट्रम, कवर किया।
कैंसर अनुसंधान में zebrafish के उपयोग हाल ही में इस जीव में मानव ट्यूमर कोशिका जेनोग्राफ्ट मॉडल की स्थापना की वजह से विस्तार किया गया है। यह पहला मानव मेटास्टेटिक मेलेनोमा कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक 2005 11 में ब्लासटुला चरण में zebrafish भ्रूण में engrafted रहे थे के साथ सूचना मिली थी। कई स्वतंत्र प्रयोगशालाओं विभिन्न साइटों और विकास के चरणों में zebrafish में स्तनधारी कैंसर की कोशिकाओं को लाइनों की एक विविध रेंज शुरू करने से इस अग्रणी काम करने की व्यवहार्यता की पुष्टि की है 5 </ Sup>। उदाहरण के लिए, blastodisc और ब्लासटुला चरण के ब्लास्टोसिस्ट के पास इंजेक्शन; जर्दी थैली, perivitelline अंतरिक्ष, Cuvier (डॉक्टर) की वाहिनी, और 6-एच के पीछे कार्डिनल नस 5 दिन की उम्र में भ्रूण के लिए में इंजेक्शन; और 30 दिन की उम्र में immunosuppressed लार्वा के पेरिटोनियल गुहा में इंजेक्शन 5 प्रदर्शन किया गया है, 12। साथ ही, अनुवांशिक रूप से भिन्न ट्यूमर प्रत्यारोपण भी zebrafish 12, 13 में सूचित किया गया। xenografts का उपयोग कर के महान लाभ यह है engrafted कैंसर की कोशिकाओं को आसानी से fluorescently लेबल और सामान्य कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। इसलिए, microtumor गठन 14, सेल आक्रमण और मेटास्टेसिस 15, 16, 17, ट्यूमर प्रेरित एंजियोजिनेसिस 15, 1 की गतिशील व्यवहार की जांच8, और कैंसर की कोशिकाओं और मेजबान के बीच संपर्क के कारकों 17 स्पष्ट रूप से जीवित मछली शरीर में देखे जा सकते हैं, खासकर जब ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों लागू किए जाते हैं 5।
डॉक्टर इंजेक्शन 16 के माध्यम से zebrafish भ्रूण: zebrafish जेनोग्राफ्ट मॉडल की उच्च क्षमता से प्रेरित होकर मेटास्टेसिस मूल्यांकन करने के लिए, हम टीजी (EGFP fli) की टेलफिन क्षेत्र में विभिन्न स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के transvascular परिस्त्राव गुणों का प्रदर्शन। विकास कारक-β (TGF-β) 16 और हड्डी morphogenetic प्रोटीन बदलने की भूमिका (बीएमपी) प्रो- / विरोधी स्तन कैंसर कोशिका आक्रमण और मेटास्टेसिस में 19 संकेत रास्ते भी इस मॉडल में जांच की गई। इसके अलावा, हम भी intravasation perivitelline अंतरिक्ष इंजेक्शन के साथ जेनोग्राफ्ट zebrafish मॉडल का उपयोग कर संचलन में विभिन्न स्तन कैंसर कोशिका लाइनों की क्षमता recapitulated।
<p claएस एस = "jove_content"> यह लेख zebrafish जेनोग्राफ्ट perivitelline अंतरिक्ष या दस्तावेज़ में मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं के इंजेक्शन पर आधारित मॉडल के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करना, हम रक्त वाहिकाओं में intravasation और विभिन्न मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं, जो avascular टेलफिन क्षेत्र में रक्त वाहिकाओं से स्थानांतरित की आक्रामक व्यवहार के प्रतिनिधि प्रक्रिया दिखा।Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish भ्रूण, perivitelline अंतरिक्ष और डॉक्टर इंजेक्शन के साथ: यहाँ, हम टीजी (EGFP fli1) में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के आक्रामक व्यवहार की जांच के लिए दो विधियों का वर्णन किया। रासायनिक डाई या ट्रांसजेनिक zebrafish भ्रू?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TGF-β परिवार के सदस्यों पर अध्ययन कैंसर जीनोमिक्स केंद्र नीदरलैंड द्वारा समर्थित हैं। सिजिया लिउ और जियांग रेन लीडेन विश्वविद्यालय में अध्ययन के 4 साल के लिए चीन छात्रवृत्ति परिषद द्वारा समर्थित हैं। हम MCF10A सेल लाइनों के लिए डॉ फ्रेड मिलर (बारबरा एन Karmanos कैंसर संस्थान, डेट्रॉइट, MI, संयुक्त राज्य अमरीका) धन्यवाद।
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
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