Rensning af High Molecular Weight Genomisk DNA fra meldug for lang Læs sekventering
Summary
Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.
Abstract
De meldug svampe er en gruppe af økonomisk vigtige svampe plantepatogener. Relativt lidt er kendt om den molekylære biologi og genetik disse patogener, delvis på grund af mangel på veludviklede genetiske og genomiske ressourcer. Disse organismer har store, gentagne genomer, som har gjort genomsekvensering og samling uoverkommeligt vanskelig. Her beskriver vi fremgangsmåder til indsamling, ekstraktion, oprensning og kvalitetskontrol vurdering af højmolekylært genomisk DNA fra en pulveragtige meldug arter, Golovinomyces cichoracearum. Den beskrevne protokol indbefatter mekanisk sønderdeling af sporer efterfulgt af en optimeret phenol / chloroform genomisk DNA ekstraktion. Et typisk udbytte var 7 ug DNA pr 150 mg konidier. Det genomiske DNA, der isoleres ved anvendelse af denne procedure er anvendelig til lang læse sekventering (dvs.> 48,5 kbp). Kvalitetskontrol foranstaltninger for at sikre størrelse, udbytte og renhed af det genomiske DNA er ogsåbeskrevet i denne fremgangsmåde. Sekventering af det genomiske DNA af kvaliteten beskrevet her vil give mulighed for samling og sammenligning af flere meldug genomer, hvilket igen vil føre til en bedre forståelse og forbedret kontrol af denne land- patogen.
Introduction
Meldug er en gruppe af obligate biotrofe svampe plantepatogener at, når de tages sammen, er den største årsag til plantesygdom på verdensplan en. Der er over 900 beskrevne arter af meldug, som er blevet taksonomisk inddelt i fem stammer i familien Erisyphaceae 2. På grund af både til deres økonomiske betydning og det intime forhold de udvikler med deres værter, har meldugsygdomme været genstand for forskning i> 100 år. Ved infektion, meldug fremkalde drastiske ændringer i den cellulære struktur, metabolisme og molekylærbiologien for deres værter, til gavn dette patogen. Men studiet af meldug er særligt udfordrende på grund af deres obligate livsstil, og vækst af svampen i ren kultur er endnu ikke blevet beskrevet 3, 4, 5,"xref"> 6, 7, 8. Pålidelig, stabil genetisk transformation af meldug har heller ikke endnu blevet opnået, selv forbigående transformation er blevet rapporteret i nogle arter 9, 10.
Sekventeringen og samling af pulveragtige meldug genomer har vist sig vanskelig på grund af en række karakteristiske træk ved selve genomet. Pulveragtige meldug genomer er store (120 – 180 Mbp) i forhold til andre fungale genomer, og består på 60 – 90% jævnt fordelte repetitive elementer 11. Disse elementer indbefatter ikke-lange terminale gentagelser, såvel som kategoriseret repetitive elementer. To formae specialis af en enkelt meldug arter, Blumeria graminis f. sp. hordei og f. sp. tritici (Bgh og Bgt henholdsvis), såvel som den drue meldug Erysiphe necator, har bin sekventeret, og udkast genomer i flere andre er blevet afsluttet 12, 13, 14. Repetitive karakter af genomerne har gjort samling vanskelig og den færdige Bgh genomet blev samlet i 6.989 supercontigs med en L50 af 2 Mb 12.
Trods den store genom, de meldug synes at have et lille antal proteinkodende gener, med 5,845 og 6.540 gener forudsagt i Bgh og Bgt hhv. De sekventerede meldug synes også at mangle mindst 99 centrale gener, der er væsentlige i andre svampe, som er i overensstemmelse med afhængighed af svampe på deres værtsplante for overlevelse 11, 12, 13, 14.
Repetitive sekvenser nær telomere, centromerer, ribosomale RNEt gen arrays og regioner beriget med transposable elementer er dårligt samlet af korte læse sekventerings strategier og er ofte underrepræsenteret i genom samlinger 15. Sådanne regioner menes at være ansvarlig for mange af de huller, som opstår i genomsekvenser, og dette gælder for de meldug med deres omfattende udvidelse af repetitive elementer 16. Stærkt plast genomregioner findes ofte i sådanne repetitive regioner 3. De tjener som en lokalitet af kromosomomlejringer og ofte koder gener under stærk selektivt tryk, såsom generne kodende effektor-proteiner og de gener, der koder for enzymer af sekundær metabolisme. Fremskridt i enkelt-molekyle lang læst sekventeringsteknologier giver en mulig løsning til sekventering tværs repetitive regioner af genomer 15. For eksempel Faino et al. (2015) fandt, at herunder lang sekvens læst teknologier og optisk mapping tillod dem at frembringe et hul-mindre genom sekvens for to stammer af den fungale plantepatogen Verticillium dahlia, tredobling af andelen af repetitive DNA sekvenser i genomet, øge antallet af gen anmærkninger (og reducere antallet af delvis eller manglende gen anmærkninger ) og afslørende genom omlejringer 17.
At ansætte disse lange-read sekventering teknologier, høje koncentrationer af høj kvalitet genomisk DNA, med minimal størrelser> 20 kb, er nødvendige. Her beskriver vi vores fremgangsmåder til konidial indsamling, oprensning af højmolekylært DNA fra konidier og vores kvalitetskontrol vurderinger ved hjælp meldug arter Golovinomyces cichoracearum dyrket på agurk 18. Denne protokol er baseret på en protokol udviklet i B. Keller laboratorium gruppe (University of Zurich, Zürich Schweiz) 13, 19og omfatter flere modifikationer, som førte til øget DNA udbytter og en højere andel af DNA> 48,5 kbp i størrelse. Protokollen omfatter også kontrol trin kvalitet baseret på anbefalinger fra det amerikanske energiministerium Fælles Genome Institute 20, 21, 22.
Funktionen af hvert reagens inkluderet i lysepuffer, og begrundelsen for hver oprensningstrin, er som beskrevet i Henry (2008) 23. Tilgængelige publicerede protokoller til isolering af højmolekylært genomisk DNA fra plante- og mikrobielle væv blev også hørt under udformningen af denne protokol 24, 25, 26, 27, 28.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at opnå rent, højmolekylært genomisk DNA fra den obligate biotrofe meldug svampe, blev en modificeret version af tidligere beskrevne fremgangsmåder udviklet 30. Det gennemsnitlige udbytte ved anvendelse af denne optimerede protokol er 7 ug DNA pr 150 mg konidier, en fordobling af udbyttet opnået med en forudgående protokol. , Den gennemsnitlige størrelse øges også fra ca. 20 kb til over 48,5 kb. Denne protokol blev optimeret i agurk G. cichoracearum system. For at opnå den …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol was developed in support of a Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). The work was supported in part by the Philomathia Foundation, the National Science Foundation (#0929226) and the Energy Biosciences Institute to S. Somerville; and by Swiss National Science Foundation (#310030_163260) to B. Keller. We would like to thank our colleagues, M. Figureroa and M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) and S. Xiao (University of Maryland) for their generous advice and for volunteering their protocols as we developed the protocol described here.
Materials
| MM400 Ball Mill | Retsch | 20.745.0001 | Or equivalent ball mill |
| 2mL tubes for ball milling | Sarstedt | 72.694.007 | |
| 5/32" stainless steel milling balls | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge | Krakeler Scientific | 38-022621807 | Or equivalent microcentrifuge |
| Chlorform:IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v) | Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| 100% Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Chill to -20°C prior use |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnase, Dnase-free (10mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Potassium metabisulfite | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodium Lauryl Sacroinate | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | Or equivalent eyewear |
| High Five COBALT nitrile gloves, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | Or equivalent gloves |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000X in water | Biotium | 41003 | |
| Ethidium Bromide 10mg/ml | Biotium | 40042 | Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear |
| Agarose Ultrapure Bioreagent | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1332 | |
| 8-48kb CHEF DNA size standards | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | Or equivalent pulse-field gel aparatus |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001042 | Or equivalent growth chamber |
| Percival Growth Chamber | Percival | AR66LXC9 | |
| NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | Or equivalent spectrophotometer |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Dilute 1/50 with water before use (to 1X) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borate-EDTA, 10X Solution (Electrophoresis) | Thermo Fisher Scientific | BP13334 | Dilute 1/10 with water before use (to 1X) |
| Liquid Nitrogen | Liquid nitrogen (-196 °C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container |
References
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1969).
- Braun, U., Cook, R. T. . Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , (2012).
- Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen. Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).
- Glawe, D. A. The powdery mildews: A review of the world’s most familiar (yet poorly known) plant pathogens. Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).
- Fabro, G., et al. Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation. Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).
- Hückelhoven, R., Panstruga, R. Cell biology of the plant-powdery mildew interaction. Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).
- Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O’Connell, R. Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria. Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).
- Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators. Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).
- Spanu, P. D., Panstruga, R. Powdery mildew genomes in the crosshairs. New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).
- Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia. BMC Microbiol. 15 (20), (2015).
- Hacquard, S., Francis, M. M. . Advances in Botanical Research. 70, 109-142 (2014).
- Spanu, P. D., et al. Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism. Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).
- Wicker, T., et al. The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph. Nat Genet. 45 (9), 1092 (2013).
- Jones, L., et al. Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator. BMC Genomics. 15, 1081 (2014).
- Thomma, B. P. H. J., et al. Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies. Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).
- Parlange, F., et al. A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome. Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).
- Faino, L., et al. Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome. mBio. 6, (2015).
- Adam, L., et al. Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens. Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).
- Bourras, S., et al. Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew. Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).
- Henry, R. J. . Plant genotyping II: SNP technology. , (2008).
- Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species. Plant Methods. 10 (21), (2014).
- Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).
- Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta. Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105 (2015).
- Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).
- Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga. PLoS One. 9 (5), e96470 (2014).
- Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1. 유전학. 158 (3), 1301-1309 (2001).
