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Summary
갤럭시 다윗은 생물 정보학 교육을받지 않은 상태에서 연구자들은 분석하고 RNA-SEQ 데이터를 해석 할 수 있도록 인기있는 도구로 등장했다. C. elegans의 연구원들은 RNA-SEQ 실험, 액세스를 수행 갤럭시를 사용하여 데이터 집합을 처리하고 DAVID를 사용하여 유전자 목록에서 의미있는 생물학적 정보를 얻을 수 있도록 우리는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
차세대 시퀀싱 (NGS) 기술은 생물 조사의 본질을 혁명을 일으켰다. 이들 중, RNA 시퀀싱 (RNA-SEQ)는 유전자 발현 분석 및 사체 매핑을위한 강력한 도구로 떠오르고있다. 그러나 RNA-SEQ 데이터 세트를 처리하는 것은 복잡한 계산 전문 지식을 필요로하며, 생물학 연구자 고유의 과제를 포즈. 이 병목 현상은 유전자 온톨로지 (GO) 기간 분석 스위트는 데 도움이 생물 정보학 기술이없는 사용자가 RNA-SEQ 데이터를 분석 할 수 있습니다 오픈 액세스 갤럭시 프로젝트 및 주석, 시각화, 및 통합 검색 (DAVID)의 데이터베이스에 의해 완화 된 대규모 데이터 집합으로부터 생물학적 의미를 도출. 그러나 처음 사용자 및 생물 정보학 '아마추어, 이러한 플랫폼과 자기 학습과 친숙위한 시간과 위협이 될 수 있습니다. 우리는 C. elegans의 연구원이 웜 RNA를 분리하는 데 도움이됩니다 간단한 워크 플로우를 설명, RNA를-SEQ 실험을갤럭시와 데이비드 플랫폼을 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 농축을 위해 스크리닝 할 수있는 유전자의리스트를 생성하는 단계마다 파라미터를 사용자에게 원시 NGS 데이터 품질 관리 검사, 정렬, 및 차등 유전자 발현 분석 액세스 안내하는 다양한 갤럭시 모듈을 사용하는 단계적 지침을 제공 유전자 또는 DAVID 클래스를 사용하여 생물학적 과정. 전반적으로, 우리는 C. 샘플의 작은 숫자를 실행하는 처음 RNA-SEQ 실험뿐만 아니라 잦은 사용자를 착수 연구원 엘레 간스에이 문서가 정보를 제공 할 것으로 기대하고 있습니다.
Introduction
인간 게놈의 첫 번째 순서는, 프레드 생어의 디데 옥시 시퀀싱 방법을 사용하여 수행 10 년했다, 그리고 미국 약 $ 3 억 2 비용. 그러나, 설립 이후 10 년간 작은에서 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술은 가능한 한 2 주 이내에 전체 인간 게놈 염기 서열와 $ 1,000 미국을 위해하는했다. 게놈 시퀀싱 프로젝트가 빠르게 보편화되고있다으로 비용 날카로운 감소와 함께 놀라운 효율성을 시퀀싱 데이터 수집의 속도를 계속 증가 허용 새로운 NGS 장비는, 상상할 수없는 방법으로 현대 생물학에 혁명을 일으키고있다. 또한, 이러한 개발은 RNA 시퀀싱 (RNA-SEQ) 게놈 전체의 후생 유전 학적 변형 연구 DNA – 단백질 상호 작용을 통해 유전자 발현 분석과 같은 많은 다른 분야의 진전을 도금 한 인간 호스트 미생물 다양성 스크리닝. RNA-괜찮다 NGS 기반특히 q는 가능 종합적으로 정확성과 민감도와지도의 전 사체를 확인하고했다, 그리고 발현 프로파일 링에 대한 선택의 방법으로 마이크로 어레이 기술을 대체하고있다. 마이크로 어레이 기술은 광범위하게 사용되었지만, 이러한 교차 혼성화하고 신뢰성있게 측정 할 수있는 발현 변화의 제한 범위로 기존의 공지 된 유전자 정보 배열 및 다른 단점에 대한 의존도에 의해 제한된다. RNA-SEQ, 다른 한편으로는, 인해 명확한 DNA 매핑 특성으로 낮은 배경 잡음을 생산하면서 알려진 알려지지 않은 성적을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. RNA-SEQ는 효모와 같은 모델 생물에서 제공하는 수많은 유전자 도구, 파리와 함께, 벌레, 물고기와 마우스는 많은 중요한 최근 생물 의학 발견을위한 기반을 역임했다. 그러나, 저장의 한계, 처리, 그리고 무엇보다도, m을 포함하여 폭 넓은 과학 사회에 액세스 할 NGS을 중요한 과제 남아 시퀀싱 대용량 데이터의 eaningful 생물 정보 분석.
시퀀싱 기술과 기하 급수적 인 데이터 축적의 급속한 발전 연구원, 액세스 분석하고이 정보를 이해 할 수 있도록 전산 플랫폼을위한 큰 필요를 만들었습니다. 초기 시스템은 컴퓨터 프로그래밍 지식에 의존했다, 반면, 프로그래머가 아닌 액세스하고 정교한 분석을 허용하지 않은 데이터를 시각화 할 수와 같은 NCBI 같은 게놈 브라우저. 웹 기반 오픈 액세스 플랫폼, 갤럭시 ( https://galaxyproject.org/ ),이 공백을 채워 NGS 데이터를 처리하고의 스펙트럼을 수행 할 수있는 연구를 할 수있는 귀중한 파이프 라인 것으로 입증되었습니다 단순하고 복잡 생물 정보 분석. 갤럭시 안톤 Nekrutenko (펜실베니아 주립 대학)과 제임스 테일러의 실험실에 의해 처음 설립되었으며 유지 (존스 홉킨스 대학)F "> 3. 갤럭시는. 그것에게 RNA-SEQ 연구에 참여한 모든 단계를 포함하여 수많은 생물 정보학 요구에 대한 '원 스톱 쇼핑'을 만드는 연산 작업의 넓은 범위를 제공하는 자사의 서버 또는 하나의 데이터 처리를 수행하는 사용자를 Itallows 로컬 자신의 컴퓨터에. 데이터 및 워크 플로우를 재현하고 공유 할 수 있습니다. 온라인 자습서, 도움말 섹션, 그리고 위키 페이지 ( https://wiki.galaxyproject.org/Support 갤럭시 프로젝트에 전념가) 일관성있는 지원을 제공합니다. 그러나, 처음 사용자를 위해, 특히 어떤 생물 정보학 교육 사람들은, 파이프 라인이 어려운 나타날 수 있으며 자기 학습과 친숙의 과정은 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 또한, 생물학적 시스템을 연구하고 실험 및 방법의 세부 사항은 영향을 사용 여러 단계의 분석 의사 결정, 이들은 지시없이 이동하기가 어려울 수 있습니다.
전반적인 RN A-서열 갤럭시 워크 플로우는 데이터 업로드 및 RNA-SEQ 데이터 분석 (10)의 각 단계에 필요한 다양한 도구의 집합 인 턱시도 스위트 4, 5, 6, 7, 8, 9를 이용하여 분석 하였다 품질 검사 이루어져 11, 12, 13, 14. 일반적인 RNA-SEQ 실험 실험 부분 (시료 전처리, mRNA의 단리 된 cDNA 라이브러리 제조)로 구성되어 상기 NGS 및 정보학 데이터 분석. 이러한 섹션, 갤럭시 파이프 라인에 포함 된 단계의 개요는 그림 1에 나타내었다.
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그림 1 : RNA-SEQ 워크 플로우의 개요. 두 웜 균주 (각각 A 및 B, 오렌지색 및 녹색 선 및 화살표)의 유전자 발현 양상을 비교하기 위하여 RNA-SEQ 실험에 관련된 실험 및 계산 단계들의 그림. 갤럭시 이용의 다른 모듈이 적색으로 표시 우리의 프로토콜에 대응하는 단계와 박스에 도시된다. 다양한 동작의 출력은 청색에 도시 된 파일 포맷이 회색에 기록된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
턱시도 스위트의 첫 번째 도구는 'Tophat'라는 맞춤 프로그램입니다. 그것은 NGS 입력이 작은 조각으로 읽은 다음 참조 게놈에 매핑 분해. 이러한 2 단계 공정은 그와 정렬 달리 디 될 수 인트론 영역에 걸쳐 판독 보장srupted 또는를 차지하고 매핑됩니다 놓쳤다. 이것은 커버리지를 증가시키고, 새로운 접합 접합부의 식별을 용이하게한다. Tophat 출력은 두 개의 파일 (게놈 위치를 포함 스플 라이스 접합에 대한 정보) 침대 파일 (각 읽기의 매핑 정보 포함) BAM 파일로보고됩니다. 다음으로, BAM 파일은 '커프스'라는 턱시도 스위트의 다음 도구를 사용하여 각 샘플 내의 개별 성적 증명서의 풍요 로움을 추정 참조 게놈에 정렬됩니다. 전체 길이 사체 조각 또는 모든 유전자에 대한 입력 데이터의 모든 가능한 스플 라이스 변종에 걸쳐 'transfrags'을보고 정렬을 스캔하여 커프스 기능을. 이것에 기초하여, 서열 분석되는 각각의 샘플 (각 유전자에 대한 유전자 당 생성 된 모든 증명서의 조립)는 '사체'를 생성한다. 이 커프스 어셈블리는 붕괴 또는 재와 함께 병합된다ference 게놈 다음 도구 'Cuffmerge'를 사용하여 다운 스트림 차동 분석을위한 하나의 주석 파일을 생성합니다. 마지막으로, 최종 Cuffmerge 출력 파일 (도 1)에 대한 각 시료의 TopHat 출력을 비교하여 샘플 간의 'Cuffdiff'공구 측정 차등 유전자 발현. 커프스 단추가 FPKM / RPKM 사용 증명서의 존재비를보고 값을 (조각을 / 매핑 만 당 사본의 당 킬로 읽고 읽습니다). 유전자 길이 (카운트 수준과 비교하는 유전자의 길이를 정규화 할 필요가 있으므로 유전자가 서로 다른 길이를 갖는 (a 참조 게놈 정렬 샘플로부터 판독 평균 수)이 값은 깊이 원료 NGS 데이터의 정규화를 반영 ) 유전자 간. , FPKM가 사용되는 반면 FPKM RPKM과는 본질적으로 모든 판독 한 조각에 해당하는 단일 엔드 RNA-SEQ 사용되고 RPKM와 동일한 쌍의 엔드 RNA-SEQ 그것은 두 동일한 단편에 해당 할 수 판독 사실을 차지한다. 궁극적으로, 이러한 분석의 결과가 차분 테스트 조건 및 / 또는 균주의 유전자 발현 사이의 목록이다.
성공적인 갤럭시 실행이 완료되고 '유전자 목록'이 생성되면, 다음 논리적 단계는 데이터 세트에서 의미있는 지식을 추론하는 분석 많은 생물 정보학을 필요로한다. 많은 소프트웨어 패키지는 DAVID 15 (주석, 시각화 및 통합 검색을위한 데이터베이스)로 공개적으로 이용 가능한 웹 기반의 전산 패키지를 포함, 이러한 요구에 부응하기 위해 등장했다. DAVID는 집적 생물학적 지식에 업로드 된 유전자의리스트를 비교하여 유전자 목록과 관련된 생물학적 통계를 공개하여 높은 처리량 연구 대규모 유전자 목록에 생물학적 의미를 부여 용이하게한다. 이것은 즉 농축 분석, 뒤에 IDE에 대한 테스트생물학적 방법 또는 유전자 클래스는 통계적으로 유의 한 방식으로 상기 유전자의리스트 (들)에 과대 대표되는 경우 ntify. 이 때문에 폭 넓은 통합 된 지식베이스와 내 풍부한 생물 테마 감지하는 연구자 수 있도록 강력한 분석 알고리즘의 조합으로 인기있는 선택이되었다 게놈을 파생 '유전자 목록'(10), (16). 추가 장점은 시퀀싱 플랫폼과 매우 사용자 친화적 인 인터페이스에 생성 유전자 목록을 처리 할 수있는 능력을 포함한다.
선충 Caenorhabditis 엘레 간스 잘 같은 작은 크기, 투명 몸, 간단한 몸 계획, 문화의 용이성과 유전 및 분자 해부에 큰 복종 할 의무로서 많은 장점 알려진 유전자 모델 시스템입니다. 웜 알려진 인간 동족체 (17) 40 %까지 보존 된 유전자를 포함하는 소형 단순하고 잘 주석 게놈을 갖는다. 실제로, C.는 엘레 간스제 18 게놈 완전히 서열화 된 후생 동물 및 RNA-SEQ 유기체의 전 사체 (19), (20)을 매핑하는 데 사용 된 제 1 화학 종 중 하나였다. 초기 웜 연구는 기술 (21), (22)의 발전에 기여 높은 처리량 RNA 캡처, 도서관 준비와 순서뿐만 아니라 생물 정보학 파이프 라인에 대한 다른 방법으로 실험을하고있었습니다. 최근 몇 년 동안, 웜에서 RNA-SEQ 기반 실험이 보편화되고있다. 그러나, 기존의 웜 생물 학자에 대한 RNA-SEQ 데이터의 전산 분석에 의해 제기 된 문제는 기술의 더 나은 활용을위한 주요 장애물이 남아있다.
이 글에서, 우리는 선충에서 발생하는 높은 처리량 RNA-SEQ 데이터를 분석하는 갤럭시 플랫폼을 사용하기위한 프로토콜을 설명합니다. 많은 처음 작은-SCA를 들어제작 : 사용자는 RNA를-SEQ 실험을 수행 할 수있는 가장 비용 효율적이고 간단한 방법은 실험실에서 RNA를 분리하고 염기 서열의 cDNA 라이브러리의 준비 및 NGS 자체에 대한 상용 (또는 사내) NGS 시설을 활용하는 것입니다. 따라서, 우리가 처음 분리하는 단계를 설명 한 C의 정량 및 품질 평가는 RNA-서열에 대한 RNA 샘플을 엘레 간스. 다음으로 정렬 조립 한 유전자 발현의 차이 정량화 하였다 후 시퀀싱 품질 제어 검사를위한 검사로 시작 NGS 데이터의 분석을위한 갤럭시 인터페이스를 사용하여 단계별로 설명 제공. 또한, 우리는 데이비드를 사용하여 생물 농축 연구를위한 갤럭시로 인한 유전자 목록을 면밀히 검토하는 방향을 포함했다. 워크 플로의 마지막 단계로, 우리는 NCBI에 순서 읽기 아카이브 (SRA) (공공 서버에 RNA-SEQ 데이터를 업로드하기위한 지침을 제공 에 http : // www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) 과학계에 자유롭게 접근 할 수 있도록합니다. 전반적으로, 우리는이 문서가 샘플의 작은 숫자를 실행하는 처음 RNA-SEQ 실험뿐만 아니라 잦은 사용자를 착수 웜 생물 학자에 포괄적이고 충분한 정보를 제공 할 것으로 기대하고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현대 생물학의 갤럭시 시퀀싱 플랫폼의 중요성
갤럭시 프로젝트 처리하고 빠르고 효율적인 방법으로 높은 처리량 시퀀싱 데이터를 분석하는 생물 정보학 교육을받지 않은 상태에서 생물학을 돕는 수단이되고있다. 일단이 공개적으로 사용 가능한 플랫폼은, 간단 신뢰성, 쉬운 과정 NGS 데이터를 분석하는 복잡한 생물 정보학 알고리즘을 실행했다, 헤라클레스의 작업을 고려했?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 갤럭시 다윗을 개발, 따라서 과학적인 지역 사회를위한 NGS 광범위하게 액세스 가능하게 한 실험실, 개인과 단체에 감사의 뜻을 전하고 싶습니다. 우리의 생물 정보학 교육 과정 피츠버그 대학의 동료가 제공하는 도움과 조언이 인정된다. 이 작품은 수상 (AG-NS-0879-12)와 국립 보건원 AG에 (R01AG051659)에서 보조금을 노화에 엘리슨 의료 재단 신규 장학생에 의해 지원되었다.
Materials
| RNase spray | Fisher Scientific | 21-402-178 |
| Trizol | Ambion | 15596026 |
| Sonicator | Sonics Vibra Cell | VCX130 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415C |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 |
| 2-propanol | Fisher Scientific | A416P-4 |
| Ethanol | Decon Labs | 2705HC |
| RNase-free water | Fisher Scientific | BP561-1 |
| Bioanalyzer | Agilent | G2940CA |
| Mac/PC |
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