פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer
Summary
בזאת אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 (Aβ40) פפטידים, מסוגל היווצרות oligomer. בטא עמילואיד הוא פפטיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד מעורב מחלת אלצהיימר. אופי amyloidogenic של הפפטיד עושה הטיהור שלה אתגר.
Abstract
Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer’s disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase – styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.
Introduction
מחלת האלצהיימר היא הפרעה ניוונית של מערכת העצבים כי תופעות למעלה מ -35 מיליון בני אדם ברחבי העולם. 1 מעורב מאוד ב שתחילתה והתפתחותה של המחלה, היא בטא עמילואיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד פפטיד (Aβ). 2 Aβ נע בין 36 כדי 43 חומצות אמינו אורך, עם זאת, הוא חשב כי גרסת חומצה 42-אמינו, עמילואיד בטא 42 (Aβ42), הוא הצורה הרעילה ביותר של החלבון. 3 זה נובע לרוב ליכולת של Aβ42 להיווצר קושי diffusible, מינים oligomeric כי הם האמינו להיות ישויות הנוירו במיוחד. 4 על מנת לקדם את ההבנה שלנו של הפפטיד Aβ, זה הכרחי כדי להשיג חומר טוהר גבוה באופן שיגרתי. הנוכחות של זיהומי עקבות הוכחה לשנות את מאפייני נטיית צבירה דראמטי של הפפטיד. 5
Traditionally, כרומטוגרפיה הנוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC) הפרדת פפטידים הידרופובי כגון Aβ נעשתה באמצעות שילוב של C 4 או C 8 שלבים נייחים מבוסס סיליקה לבין שלב נייד חומצי. 6 עם זאת, בתנאים כאלה יכולים להוות אתגר הטיהור של הפפטיד. הנקודה איזואלקטרית הנמוכה של הפפטיד Aβ (PI כ 5.5) 7 כלומר בתנאים חומציים, צבירת פפטיד הוא גדל וכתוצאה מכך רחבות, שאינו נפתרו פסגות HPLC כי הם לעתים קרובות קשים לבודד מיוצרים (איור 2 א). יתר על כן, פסגות רחבה כל כך בדרך כלל מכילות זיהומים היכולים להשפיע על פרופיל אגרגציה של הפפטיד, ובדרך כלל דורשים סיבובים הבאים של טיהור אשר יכול באופן דרמטי להשפיע על כמות פפטיד המיוצר.
פולי (סטירן / divinylbenzene) בשלב נייח, PLRP-S, מייצג אמצעים חלופיים תחנותפפטידים הידרופובי יינג. השלב נייח הועסק בתחום הטיהור של מספר חלבונים שונים וחומצות ריבונוקלאית שליח (mRNA). 8, 9 השלב נייח-S PLRP לא דורש ליגנד אלקיל נוספות עבור הפרדת פאזות הפוכה, ויותר מכך הוא יציב מבחינה כימית ב- pH גבוה אשר מוביל deaggregation של הפפטיד. 7 בזאת, אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 פפטידים (Aβ40).
Protocol
Representative Results
Discussion
טיהור HPLC של הפפטיד Aβ תלויה מאוד על הבחירה של שני השלב הנייח המועסקים בתחום הטיהור בשלב הנייד נבחר כדי elute הפפטיד. הנקודה איזואלקטרית הנמוכה של הפפטיד ואת הנטייה גבוהה עבור צבירה לדקלם תנאי chromatographic מסורתיים להפרדת חלבונים הידרופובי (C4 או בשלב נייח C8 מצמיד עם eluent הניי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות Agilent לקבלת הסיוע הטכני שלהם. קייט מרקהאם ורפאל פלומינו מזוכים לעזרה הראשונית שלהם בסינתזה וטיהור של הפפטיד Aβ וד"ר Hsiau-וויי לי הוא הודה על עזרתו בהכנת איור 1 של כתב היד.
Materials
| Agilent 1260 Infinity II quarternary pump | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Ring Stand Mounting Bracket | Agilent | 1400-3166 | |
| PEEK Tubing Blue (1/32" outer diameter х 0.010" internal diameter) | Thermo Scientific | 03-050-399 | |
| Agilent PLRP-S 300Å 8µm 25 х 300 mm column (Preparative) | Agilent | PL1212-6801 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Agilent PLRP-S 300Å 8µm 7.5 х 300 mm (Semi-Preparative) | Agilent | PL1112-6801 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Agilent PLRP-S 300Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ42 or Aβ40 peptide | Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer. | ||
| Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5cc sterile syringe | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 Gauge SS Needle | Rheodyne | 3725-086 |
References
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer’s Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Gong, Y., et al. Alzheimer’s disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
- Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
- Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
- Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer’s Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
- Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
- Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
- Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
- Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
- Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer’s Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
- Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
- Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).
