オリゴマー形成可能な高純度のアミロイドベータ42とアミロイドベータ40ペプチドを、利回りテーラードHPLC精製プロトコル
Summary
ここで我々は、オリゴマー形成が可能な高純度のアミロイドベータ42（Aβ42）とアミロイドベータ40（Aβ40）のペプチドを、もたらす仕立てHPLC精製プロトコルを報告しています。アミロイドベータは、アルツハイマー病に関与する高度に凝集しやすい、疎水性ペプチドです。ペプチドのアミロイド形成性の性質は、その精製の挑戦になります。
Abstract
Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer’s disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase – styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.
Introduction
アルツハイマー病は、全世界で3,500万人を超える人々に影響を与える神経変性疾患です。疾患の発症と進展に強く関与する1は 、非常に凝集しやすい、疎水性ペプチドのアミロイドベータ（Aβ）です。 2Aβしかし、アミロイドベータ42（Aβ42）は、タンパク質の最も有毒な形態の42アミノ酸の変異体であると考えられている、長さが36〜43個のアミノ酸の範囲です。 3これは容易に拡散し、特に神経毒性実体であると考えられているオリゴマー種を形成するAβ42の能力に大部分で起因します。 図4は、Aβペプチドの我々の理解を促進するためには、日常的に高純度の材料を得ることが不可欠です。微量の不純物の存在は、劇的に、ペプチドの凝集性向特性を変化させることが示されています。 5
Traditionally、例えば、Aβのような疎水性ペプチドの高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分離は、C 4またはC 8シリカベース固定相及び酸性移動相の組み合わせの使用を介して行われてきました。 6しかし、そのような条件は、ペプチドの精製に挑戦を提示することができます。 Aβペプチド（pIが約5.5）の低い等電点7は 、酸性条件下でいることを意味する（ 図2A）ペプチド凝集が増加し、結果としてしばしば単離することが困難である広い、非分解HPLCピークが生成されます。さらに、このようなブロードなピークは、多くの場合、ペプチドの凝集特性に影響を与え、そして一般的に劇的に産生されるペプチドの量に影響を与える可能性精製のその後のラウンドを必要とし得る不純物を含有します。
ポリ（スチレン/ジビニルベンゼン）固定相、PLRP-Sは、purifの代替手段を表し、瑛疎水性ペプチド。固定相は、異なるタンパク質とメッセンジャーリボ核酸（mRNA）の多数の精製に使用されています。 8,9 PLRP-S固定相は逆相分離のための付加的なアルキルリガンドを必要とせず、そしてより重要なペプチドの脱凝集をもたらす高いpHにおいて化学的に安定です。 7ここでは、我々は、高純度のアミロイドベータ42（Aβ42）とアミロイドベータ40（Aβ40）のペプチドをもたらす仕立てHPLC精製プロトコルを報告しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
AβペプチドのHPLC精製は、精製に用いられる固定相とペプチドを溶出するために選択された移動相の両方の選択に大きく依存します。集約のためのペプチドおよび高傾向の低い等電点は、疎水性タンパク質の分離のための伝統的なクロマトグラフィー条件（C4または酸性モバイル溶離液と相まってC8固定相）をレンダリング挑戦、Aβペプチドは長時間の幅広いとして溶出すると、非解決ピーク?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は彼らの技術支援のためにアジレントに感謝したいと思います。ケイト・マーカムとラファエル・パロミノは、Aβペプチドの合成及び精製におけるそれらの初期支援のために入金され、博士Hsiau偉リーは、原稿の図1を調製する際に彼の助けのために感謝しています。
Materials
| Agilent 1260 Infinity II quarternary pump | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Ring Stand Mounting Bracket | Agilent | 1400-3166 | |
| PEEK Tubing Blue (1/32" outer diameter х 0.010" internal diameter) | Thermo Scientific | 03-050-399 | |
| Agilent PLRP-S 300Å 8µm 25 х 300 mm column (Preparative) | Agilent | PL1212-6801 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Agilent PLRP-S 300Å 8µm 7.5 х 300 mm (Semi-Preparative) | Agilent | PL1112-6801 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Agilent PLRP-S 300Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ42 or Aβ40 peptide | Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer. | ||
| Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5cc sterile syringe | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 Gauge SS Needle | Rheodyne | 3725-086 |
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