Un protocole Purification Tailored HPLC que les rendements de haute pureté amyloïde bêta 42 et bêta-amyloïde 40 Peptides, capable de former Oligomère
Summary
Nous rapportons ici un protocole de purification par HPLC sur mesure qui produit de haute pureté bêta-amyloïde 42 (Aß42) et de bêta-amyloïde 40 (Aß40) peptides, capable de former des oligomères. Bêta-amyloïde est un peptide hydrophobe fortement l'agrégation prédisposé impliquée dans la maladie d'Alzheimer. La nature amyloïdogène du peptide rend sa purification un défi.
Abstract
Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer’s disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase – styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.
Introduction
La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative que les effets de plus de 35 millions de personnes dans le monde entier. Impliqué 1 fermement dans l'apparition et le développement de la maladie, est la très prédisposé agrégation, un peptide hydrophobe bêta – amyloïde (Aß). 2 Aß est comprise entre 36 et 43 acides aminés en longueur, cependant, on pense que la variante de l' acide 42-amino, bêta – amyloïde 42 (Aß42), est la forme la plus toxique de la protéine. 3 Cela est dû en grande partie à la capacité de Aß42 pour former facilement diffusables, les espèces oligomériques qui sont considérées comme des entités particulièrement neurotoxiques. 4 Afin d'approfondir notre compréhension du peptide Aß, il est essentiel d'obtenir régulièrement des documents de haute pureté. La présence de traces d'impuretés a été démontré que de modifier considérablement les propriétés d'agrégation de propension du peptide. 5
Traditionnellement, la chromatographie en phase liquide (HPLC) à haute performance de peptides hydrophobes tels que Aß a été accompli par l'utilisation d'une combinaison de C 4 ou C 8 phases stationnaires à base de silice et une phase mobile acide. 6 Cependant, ces conditions peuvent présenter un défi pour la purification du peptide. Le point bas du peptide Aß isoélectrique (pI environ 5,5) 7 signifie que dans des conditions acides, l' agrégation du peptide est augmentée et à la suite de larges pics HPLC non résolus qui sont souvent difficiles à isoler sont produites (figure 2A). En outre, ces larges pics contiennent souvent des impuretés qui peuvent avoir un impact sur le profil de l'agrégation du peptide, et souvent nécessiter des rondes subséquentes de purification qui peuvent influer considérablement la quantité de peptide produit.
Le poly (styrène / divinylbenzène) de la phase stationnaire, DPP-S, représente un autre moyen de purifying peptides hydrophobes. La phase stationnaire a été utilisée dans la purification d'un certain nombre de protéines et d'acides ribonucléiques messagers (ARNm). 8, 9 La phase stationnaire PLRP-S ne nécessite aucun ligand alkyle supplémentaire pour la séparation en phase inverse, et plus important encore est chimiquement stable à pH élevé qui conduit à la désagrégation du peptide. 7 Ici, nous rapportons un protocole de purification HPLC sur mesure qui donne une grande pureté bêta – amyloïde 42 (Aß42) et bêta – amyloïde 40 (Aß40) peptides.
Protocol
Representative Results
Discussion
La purification par HPLC du peptide Aß dépend fortement du choix à la fois la phase stationnaire employée dans la purification et la phase mobile choisi pour éluer le peptide. Le point bas du peptide et la forte propension pour l'agrégation isoélectrique rendent les conditions chromatographiques traditionnelles pour la séparation des protéines hydrophobes (C4 ou phase stationnaire C8 couplé avec un éluant mobiles acide) difficile, avec le peptide Aß élution comme prolongée large, non résolus pic <stro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Agilent pour leur assistance technique. Kate Markham et Rafael Palomino sont crédités pour leur aide initiale dans la synthèse et la purification du peptide Aß et le Dr Hsiau-Wei Lee est remercié pour son aide dans la préparation de la figure 1 du manuscrit.
Materials
| Agilent 1260 Infinity II quarternary pump | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Ring Stand Mounting Bracket | Agilent | 1400-3166 | |
| PEEK Tubing Blue (1/32" outer diameter х 0.010" internal diameter) | Thermo Scientific | 03-050-399 | |
| Agilent PLRP-S 300Å 8µm 25 х 300 mm column (Preparative) | Agilent | PL1212-6801 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Agilent PLRP-S 300Å 8µm 7.5 х 300 mm (Semi-Preparative) | Agilent | PL1112-6801 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Agilent PLRP-S 300Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ42 or Aβ40 peptide | Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer. | ||
| Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5cc sterile syringe | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 Gauge SS Needle | Rheodyne | 3725-086 |
References
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer’s Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Gong, Y., et al. Alzheimer’s disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
- Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
- Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
- Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer’s Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
- Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
- Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
- Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
- Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
- Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer’s Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
- Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
- Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).
