This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.
一氧化氮(NO•)是一个小的基团,其介导在哺乳动物,细菌和植物的多个重要的细胞功能。尽管有大量的用于在体内和体外检测NO•方法的存在,在单细胞水平NO•的实时监控是很有挑战性的。 NO•的生理或病理作用是通过实际的浓度决定和住这种激进的时候。因此,允许NO•的单细胞的检测方法是非常需要的。最近,我们通过引入单个荧光蛋白质基遗传编码一氧化氮(NO•)探针(geNOps),该直接响应蜂窝NO•波动,因此,解决了这一需求扩大的否•指标托盘。这里,我们证明geNOps的使用情况,以评估应对两个不同的化学NO•-liberating分子细胞内NO•信号。我们的研究结果阿尔斯如与比较ö证实,新鲜制备的3-(2-羟基-1-甲基-2-亚硝基肼基)-N-甲基-1-丙胺(NOC-7)具有高得多的电势,以唤起在细胞内NO•水平变化无机NO供体•硝普钠(SNP)。此外,进行使用绿色geNOps(G-geNOp)和化学的 Ca 2+指示剂呋喃-2双色活细胞成像可视化钙的紧调节依赖性否•形成在单一的内皮细胞。这些代表性实验证明geNOps是调查在不同的实验设置单细胞NO•信号的实时生成和降解合适的工具。
我们最近开发一类新的遗传编码的荧光否•探针,称为geNOps 1。这些传感器包括一个简单地建造,细菌衍生的,编号•结合结构域2,其缀合于不同的荧光蛋白(FP)变体3(青色,绿色或橙色,FP)的。 NO•在geNOps内绑定到非血红素铁(II)中心4即刻降低了荧光强度1。重要的是,当细胞内NO•水平下降1 geNOps荧光迅速全面复苏。因此,geNOps允许(子)蜂窝NO•波动实时成像。虽然NO•传感geNOps的机制仍不清楚,到目前为止,它们已被证明是优良的NO•记者,因而有效力开拓的多色的,定量NO•bioimagin一个新的时代克具有高空间分辨率和时间分辨率1,5。其他可用的荧光否•探针基于小化学化合物,其需要被加载到细胞中,并通过否•6不可逆地修改。 NO•敏感荧光小的其它缺点是其潜在的细胞毒性和相对较低的特殊性,这使得它难以可靠,分析和确凿的方式7,8,9使用它们。虽然基因编码荧光探针的有效使用,需要高效的基因转移技术,基于FP遗传编码传感器已成为已彻底改变了我们的细胞10,11的内运作的理解不可或缺的工具。单基于FP-geNOps的发展,一架F之前örster共振能量转移(FRET)为主否•传感器称为NOA-1 12构建。 Sato 等人。设计这个复杂探测器由NO•敏感的可溶性鸟苷酸环化酶的两个亚基(SGC),两者结合到基于FRET的传感器报告的环磷酸鸟苷(cGMP)的水平12。由于这种探测器响应cGMP的,它只是间接地检测细胞内NO•波动12。虽然NOA-1响应为NO•在纳米摩尔范围立面图,此工具尚未频繁使用到目前为止,可能是由于与本笨重偶传感器的可用性和实用性的限制。
否•,这影响基本生物过程已被充分表征13,14的多种功能。许多研究证明,NO•concentratioN个单元和子域范围内决定健康和疾病的14,15,16细胞的命运。在哺乳动物,编号•主要由良好表征的一氧化氮合酶(NOS)家族17产生酶在各种细胞类型。到目前为止,NOS的三种亚型已经描述18,19,20;这些是的Ca 2+ /钙调蛋白依赖性内皮型NOS(eNOS的或NOS-3)18和神经元型NOS(nNOS的或NOS-1)19和钙 /钙调蛋白依赖性组成型活性诱导型NOS(iNOS的或NOS- 2)20。此外,线粒体NOS(mtNOS)的存在也被建议21。然而,mtNOS被认为的nNOS的剪接变体,并且因此不单独分类作为一个亚型21。另一个同种型,除了那些在哺乳动物细胞,是所谓的细菌NOS(BNOS),主要发现在革兰氏阳性菌22。酶产生NO•的高度控制,并取决于几个辅因子的可用性,例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH),黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),四氢(BH 4),分子氧和L-精氨酸17。阳离子氨基酸L-精氨酸]是在否•生产17转化为L-瓜氨酸的衬底。除了高度管制酶促生成NO•的,它已被假定的是基团可非酶由线粒体亚硝酸盐池低氧条件23减压。一旦否•是细胞内产生的,它可以自由地通过生物膜14扩散,裁判“> 15,但是,这种激进的很短的半衰期,主要由环境条件决定,和各种途径和化学反应有效地降解NO•级别24,最终,编号•的形成,扩散和降解取决于上不同的环境参数而确定的高度生物活性分子24的有效浓度。
所述geNOps技术允许直接检测的(亚)细胞否•波动1,因此是合适的重新调查,和新发现负责蜂窝NO•信号的累积和分解的机制。在这里,我们提供简单的协议和geNOps的使用形象化外生诱发代表性结果和内源性生成的NO•型材,对单个细胞的水平。此外,该geNOps技术可适于AP折襞在其它细胞模型系统以研究响应于不同的细胞刺激和应力NO•形成,扩散和降解的复杂的图案。
因为NO•的发现如在生物学28的重要信号分子,在单细胞,组织和整个动物的可行和可靠的方式高分辨率游离基的具体实时测量已渴望。在这里,我们报告了最近开发的基因编码荧光NO•探头(geNOps)采用宽视场荧光显微镜1,使精确NO•信号的活细胞成像应用。
规避精细和侵入性的转染程序稳定表达绿色荧光的G-geNOp用于定量外源产生的单细胞否•型材的HEK细胞克隆。如HEK细胞通常不产生NO•内源性29,这种细胞类型是适合于产生一个基于geNOp传感器细胞系的,这可能是在共培养条件的许多其它应用中有用由于没有生产•原代细胞,甚至在活体动物30。然而,在此研究中,我们证明各种否•-liberating化合物的能力,将不同浓度和稳定性的,使用的G-geNOp表达的HEK细胞模型,以唤起胞内NO•信号。我们的数据显示,该NO•端供体的浓度,施用的质量和方法最终确定的细胞内NO•剖面的模式。这种信息对于不同的NO供体•,这是表明几种疾病的原位药代动力学研究是必不可少的。值得注意的是,geNOps已经示出在一个很长的时间1为NO•端供体脉冲的多个重复应用以稳定地作出响应。因此,利用NO•-liberating本文提供的化合物的实验中,允许有关各种幅度和相应的细胞NO的动力学半定量的结论226;信号( 图1和2)。
虽然稳定表达的HEK细胞克隆可能是从一个单一的细胞起源中,观察到G-geNOps表达水平的一个广泛的异质性( 图1)。这是稳定的细胞克隆的共同特征为感兴趣的(基因组整合)基因的转录是多种因素的控制下,例如,影响细胞的生长率32多样的环境胁迫31和细胞周期状态33。单基于FP-geNOps是非比例式传感器,因此,使NO•诱导与geNOp表达水平1荧光强度增加的损失。因此,geNOps信号正常化是特别是在比较分析的情况下,量化细胞NO•信号至关重要。如图所示在我们最近的研究中,有严格的线性关系between geNOps的基础荧光强度与NO•诱导荧光猝灭的在宽范围的荧光强度的强度已发现1。这是geNOps用于蜂窝NO•信号的绝对定量的一个重要特征。 如图1中 ,G-geNOps信号的归一化响应于NOC-7和SNP发现均质否•在不同HEK细胞信号从相同的板,这表明HEK细胞不多样与问候其占用容量并降低了NO•自由基是从NO•供体起源。与此相反,在HeLa细胞用geNOps证实蜂窝否•不同小区间的信号的清晰均质响应于NOC-7。这些差异指向细胞类型特异性NO•代谢和分解速率,这可能会在细胞生理和病理多种含义,并且可以使用geNOp被发现的技术。
尽管如此,geNOps的两个重要特性必须要认真考虑的传感器和数据解释的正确用法:I)geNOps需要足够的铁(II),以充分应对NO•1取决于FP变型II),geNOps可以是pH敏感1。在这里,我们描述了已被发现是适合于geNOps,其在任一HEK,海拉或将EA.hy926细胞(参见协议2.6)表示的无毒铁(II)补充的协议。虽然已经证明,与铁细胞处理(Ⅱ)/维生素C不影响细胞形态,细胞活力和细胞1的代谢活性,这可能是必要的,以优化其他细胞类型和组织这一重要步骤。然而,在某些实验条件下,铁(II)负载的要求可能会限制geNOps的适用性。值得注意的是,它已经显示,抗坏血酸可以减少氮素O•35和抗坏血酸-铁(Ⅱ)配合物是能够清除NO•36,37。此外,过量的铁(II)和抗坏血酸可诱导的炎症反应39和不耦合的eNOS 41。这种影响需要使用geNOps技术时,必须考虑。已经显示,在某些实验条件下,细胞内pH值的影响显著34,其具有以影响geNOps荧光1的潜力。值得注意的是,青色和绿色geNOps变体是相对pH敏感表示荧光的酸化时1的降低。因此,(亚)细胞pH为急性变化可能使用pH敏感geNOps当模拟假否•信号。所建议的前期工作,NO•不敏感geNOps并行使用(geNOps MUT)为阴性CONTROLS建议从pH值的变化1解剖真正的蜂窝NO•信号。除了蜂窝pH变化可使用pH探头如SypHer 34进行检查。
此外,我们在响应于内皮细胞替代将EA.hy926生理钙 -mobilizing激动剂可视内源性酶否•形成。在将EA.hy926细胞系一贯表达的eNOS 38经常使用的模型系统。在将EA.hy926细胞瞬时表达geNOps的使用,确认该IP 3介导的 Ca 2+信号唤起深刻否•形成在此细胞类型,这是几乎完全由L-NNA阻断。为了与否•信号在时间上相关的 Ca 2+,G-geNOp表达细胞装载有紫外激发的化学钙 -indicator呋喃-2 / AM。 CA的光谱分离2+绑定和非绑定呋喃-2 FLUO从G-geNOp信号rescence可以用市售滤波器设置40很容易地实现。成像两种探针推出的钙 -triggered酶NO•形成对比胞质钙离子在这种内皮细胞类型出现上升慢得多。在细胞处理的单细胞否•在从牛肺动脉血管内皮细胞的信号的类似动力学与IP 3 -产生激动剂缓激肽,以及剪切应力已使用报道NOA-1,一种间接的高度否•敏感的传感器12 。因此,这些数据强调, 钙 -evoked的eNOS衍生的NO•形成需要一定的起动时间,直至达到充分的酶活性。虽然蜂窝否•阵型,扩散和降解的动力学可以从其它数据中提取, 例如,基于张力-NO•测量诱导的血管舒张SS =“外部参照”> 26,NO荧光探针•的巨大好处是,他们直接将蜂窝NO•波动的实时可视信号。因此,成像细胞NO•与geNOps信号提供了高时空分辨率,并在(再)提供了独特的可能性调查(子)蜂窝NO•动态平衡。例如,成像的eNOS与geNOps技术在单个内皮细胞组合的穿梭42可能是合适的关联否•形成与NO•的亚细胞定位和易位-producing酶或其他相关的蛋白质如钙调蛋白和小窝蛋白43。
这里,我们描述的G-geNOp的表达的HEK和将EA.hy926细胞可视化外生和内源性生成的蜂窝否•信号在单细胞水平和实时上的传统的宽视场荧光微米切实可行应用icroscope。我们的数据暗示geNOps适合于具体跟踪使用各种有趣的细胞类型的各种实验条件下(子)蜂窝否•动力学。
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.
NaCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.20 | sodium chloride |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.1 | potassium chloride |
CaCl2 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T885.1 | calcium chloride dihydrate |
MgCl2 .6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | magnesium chloride hexahydrate |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.3 | 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8551.1 | sodium hydrogencarbonate |
KH2PO4 | Merck, Darmstadt, Germany | 104873 | potassium dihydrogen phosphate |
Na2HPO4 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.1 | sodium hydrogenphosphate dihydrate |
D(+)-Glucose monohydrate | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | >99.5%; for cell culture, endotoxin free; |
EGTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3054.2 | ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent |
NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6771.1 | sodium hydroxide |
HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4625.1 | hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N) |
DMSO | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | dimethyl sulfoxide; highly polar, aprotic organic solvent |
L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | G2128 | (S)-2-Aminoglutaric acid |
DMEM, low glucose | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | D5523 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
MEM Vitamin solution (100X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11120037 | 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
MEM Amino acids solution (50X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11130036 | 50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122.00 | antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures |
Amphotericin B | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15290026.00 | Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi |
FCS | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin |
PBS, pH 7.4 | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010031.00 | phosphate-buffered saline |
Fura-2 (AM) | Teflabs, Austin, TX, USA | 102 | fluorescent cytosolic calcium indicators |
Histamine dihydrochlorid | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | H7250 | 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist |
Nω-Nitro-L-arginine | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | N5501 | N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA; inhibitor of nitric oxide synthase |
NOC-7 | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 487952 | 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release |
Sodium nitroprusside dihydrate | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-203395A | sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound |
30-mm Cover slips | Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany | 41001130 | glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.) |
Iron(II) booster solution | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/ |
G-geNOp plasmid | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/ |
G-geNOp AAV5 | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/ |
G-geNOp sensor cell line | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/ |
HEK293A cell line | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R70507 | subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) |
EA.hy926 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany | CRL-2922 | somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549 |
TILL iMIC | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | digital microscope |
Polychrome V monochromator | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | ultra fast switching |
AVT Stingray F145B | Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany | n.a. | Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b |
alpha Plan Fluar 40 | Zeiss, Göttingen, Germany | n.a. | x40 objective |
dichroic filters | Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA | n.a. | GFP emitter 514/3 nm (515dcxr) |
ValveBank8 Controller | AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA | 01-08 | programmable perfusion system control unit |
BVC control | Vacuubrand, Wertheim, Germany | 727200 | Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system |
ImageJ software | NIH Image | Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome |