This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.
산화 질소는 (• NO) 포유 동물, 박테리아와 식물의 여러 중요한 세포 기능을 매개하는 작은 급진적이다. 생체 내 및 시험 관내에서 NO • 검출 방법의 다수의 존재에도 불구하고, 단일 세포 수준에서 NO •의 실시간 모니터링은 매우 도전적이다. NO •의 생리 학적 또는 병리학 적 효과는 실제 농도에 의해 결정이 라디칼의 시간을 살고있다. 따라서, NO •의 단일 셀 검출을 허용 방법이 매우 바람직하다. 최근에, 우리는 직접 따라서, 이러한 요구를 해결, 휴대 NO • 변동에 대응하고 단일 형광 단백질 기반의 유전자 인코딩 된 산화 질소 (• NO) 프로브 (geNOps)를 도입하여 NO • 지표의 팔레트를 확장했다. 여기에서 우리는 NO • 두 개의 서로 다른 화학 -liberating 분자에 반응하여 세포 내 NO • 신호를 평가하는 geNOps의 사용을 보여줍니다. 우리의 결과 루게릭 병비하여 갓 3- (2- 하이드 록시 -1- 메틸 -2- nitrosohydrazino) -N- 메틸 -1- 프로판 아민을 제조 오 확인은 (NOC-7) 세포 NO • 레벨의 변화를 연상 할 수있는 매우 높은 전위를 갖는다 무기 NO • 기증자 나트륨 니트 로프 루시드 (SNP). 또한, 녹색 geNOps (G-geNOp) 및 화학 물질 칼슘 2 + 표시의 Fura-2를 사용하여 듀얼 컬러 라이브 세포 이미징은 칼슘의 엄격한 규제를 시각화 하였다 의존성 NO • 하나의 내피 세포에서 형성. 이러한 대표적인 실험 geNOps은 다양한 실험 설정에서 단일 셀 NO • 신호를 실시간으로 생성 및 분해를 조사하기에 적합한 툴이라는 것을 보여준다.
우리는 최근, 유전자 인코딩 된 형광 NO의 • 프로브의 새로운 클래스를 개발 geNOps 일이라고했다. 이 센서는 서로 다른 형광 단백질 (FP) 변종 3 (시안 색, 녹색 또는 오렌지 FP) 접합 단순히 내장, 박테리아 유래, NO • 바인딩 도메인 2로 구성되어 있습니다. NO를 geNOps 내에 비 – 헴 철 (II) (4) 중심에 바인딩 • 즉시 한 형광 강도를 감소시킨다. 세포 NO • 레벨 1을 거절 할 때 중요한 것은, geNOps 형광 신속하고 완벽하게 복원한다. 따라서 geNOps은 (부) 셀룰러 NO • 변동 실시간 이미징을 허용한다. geNOps의 NO • 감지 메커니즘은 지금까지 불분명 남아 있지만, 그들은 우수한 NO • 기자, 그리고 따라서 다색, 양적 NO •의 bioimagin의 새로운 시대를 열 수있는 힘을 가지고 입증높은 공간 및 시간 해상도 1 g, 5. 사용할 수있는 다른 형광 아니오 • 프로브 세포에로드되어야하고, 비가 역적 NO • (6)에 의해 수정되는 작은 화학 화합물에 기초하지 않는다. NO • 민감한 작은 형광체의 추가적인 단점은 어려운 신뢰성 분석 및 결정적인 방식으로 7, 8, 9에서 사용할 수 있도록 잠재적 독성 및 비교적 낮은 특이성이다. 유전자 인코딩 된 형광 프로브의 효과적인 사용이 효율적인 유전자 전달 기술이 필요하지만, FP 기반 유전자 인코딩 된 센서는 셀 (10), (11)의 내부 기능에 대한 우리의 이해를 혁명 필수 불가결 한 도구로 등장했다. 하는 F 단일 FP 기반 geNOps의 개발 전örster 공명 에너지 전달 (FRET)을 아니오 • 센서 기반하지 NOA-1 (12)를 제조 하였다이라. 사토 등. 아니오 • 민감한 수용성 구아닐산 시클 라제의 두 개의 서브 유닛 (SGC), 클릭 구아노 신 모노 포스페이트 (cGMP) 수준 (12)을보고 모두 접합하는 FRET 기반 센서로 구성이 복잡한 프로브를 디자인했다. 이 프로브는 cGMP의 응답으로, 그것은 단지 간접적으로 세포 내 NO • 변동 (12)을 감지한다. NOA-1 나노 몰 범위 NO • 고도에 응답하지만,이 도구는 아마도이 부피가 큰 양자 센서의 가용성과 실용성에 대한 제한으로, 지금까지 자주 사용되지 않았습니다.
충격 기본적인 생물학적 과정이 아니라 13, 14을 특징으로 한 NO •의 다양한 기능을한다. 많은 연구가 입증 그 NO •의 concentration은 세포와 하위 도메인 내에서 건강과 질병 14, 15, 16 세포의 운명을 결정한다. mammalians에서, NO • 주로 잘 특성화 된 산화 질소 합성 효소 (NOS) 가족 (17)에 의해 다양한 세포 유형의 효소 생성됩니다. 지금까지 세 NOS 이성체 20 19 18 기재되어있다; 이들은 칼슘 / 칼 모듈 린에 의존하는 내피 NOS (eNOS의 또는 NOS-3) (18) 및 신경 NOS (nNOS에 또는 NOS-1) (19), 그리고 칼슘 / 칼 모듈 린 독립적 인 구성 적 활성 유도 NOS (iNOS의 또는 NOS- 있습니다 2) 20. 또한, 미토콘드리아 NOS (mtNOS)의 존재는도 21를 제안하고있다. 그러나 mtNOS는 nNOS에의 스플 라이스 변이체로 간주되고, 따라서 개별적으로 분류되지 이소 형 (21) 등. 다른 이성체가 분리 포유류 세포 에서와는 소위 세균 NOS (bNOS)가 주로 그람 양성균 (22)에서 발견된다. NO •의 효소 생산은 매우 아데닌 디 뉴클레오티드 (FAD), tetrahydrobiopterin (BH4), 산소 분자와 L 아르기닌 (17) 플라 빈, 제어 및 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 인산 (NADPH)와 같은 여러 가지 보조 인자의 가용성에 따라 결정된다. 양이온 성 아미노산 L- 아르기닌은 NO 생산 • 17에 L-시트룰린으로 변환되는 기판이다. NO •의 고도로 조절 효소 생성 이외에, 상기 라디칼은 저산소증 조건 하에서 23 미토콘드리아 아질산 풀에서 비 – 효소 적으로 감소 될 수 있음을 가정하고있다. NO • 셀 내에서 생성되면, 자유롭게 생체막 (14)를 통해 확산 될 수 있으며,REF "는> 15. 그러나,이 라디칼의 매우 짧은 반감기는 주로 환경 조건에 의해 결정되고, 다양한 경로와 화학 반응을 효율적으로 NO • 레벨 24 저하. 결국, NO •의 형성, 확산, 열화 의존 다양한 환경 변수에있는 고도의 생물학적 활성 분자 (24)의 유효 농도를 결정한다.
geNOps 기술 (부) 세포의 NO • 변동 (1)의 직접 검출을 허용하고 재조사하는 것이 적합하고, 새로운 세포의 NO • 신호의 축적 및 분해를 담당하는 메커니즘을 발견한다. 여기, 우리는 개별 세포의 수준에, 간단한 프로토콜과 외생 적 유발 시각화 geNOps의 사용에 대한 대표적인 결과와 내생 적으로 생성 된 NO • 프로파일을 제공합니다. 또한, geNOps 기술은 AP에 대해 적용 할 수있다다른 세포 모델 시스템의 습곡은 다양한 세포 자극과 스트레스에 반응하여 NO • 형성, 확산, 열화의 복잡한 패턴을 연구합니다.
28 생물학에서 중요한 신호 분자로서 NO •의 발견 이래, 하나의 세포, 조직 및 가능하고 신뢰성있는 방식으로 고해상도의 전체 동물 라디칼의 비 실시간 측정이 갈망되고있다. 여기에서 우리는 넓은 필드 형광 현미경 (1)을 사용하여 정확한 NO • 신호의 라이브 셀 이미징을 사용 최근에 개발 된 유전자 인코딩 된 형광 NO의 • 프로브 (geNOps)의 응용 프로그램을보고합니다.
정교하고 침략 형질 전환 절차를 안정적으로 외생 생성 된 단일 셀 NO • 프로필을 정량화하는 데 사용 된 녹색 형광 G-geNOp을 표현 HEK 세포 클론을 회피합니다. HEK 세포를 통상 NO • 내생 29 발생하지 않기 때문에, 이러한 세포 유형은 공동 배양 조건에서 다른 많은 애플리케이션에 유용 할 수도 geNOp 기반 센서 셀 라인의 발생에 적합NO로 • 기본 세포 또는 동물 (30) 생활에서의 생산. 그러나 본 연구에서 우리는 G-geNOp 발현하는 HEK 세포 모델을 사용하여 세포 내 NO • 신호를 연상 상이한 농도 안정성 및 다양한 아니오 • -liberating없는 화합물의 능력을 입증. 우리의 데이터는 응용 프로그램의 NO • -donor 농도, 품질 및 방법은 결국 세포 내 NO • 프로필의 패턴을 결정하는 것으로 나타났습니다. 이러한 정보는 여러 가지 질병을 나타내는 서로 다른 NO • 기증자의 현장에서의 약동학 적 특성에 필수적이다. 특히, geNOps 안정적 매우 오랜 시간이 1 위에 NO • -donor 펄스의 여러 반복적 인 애플리케이션에 대응하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 명세서 화합물을 -liberating • NO를 사용하여 실험, 다양한 진폭과 각 세포의 NO의 반응 속도에 관한 반 정량적 인 결론 허용(226); 신호 (도 1 및도 2).
안정하게 발현하는 HEK 세포 클론 아마도 단일 세포에서 유래하지만, G-geNOps 발현 수준의 넓은 이질성 (도 1)을 관찰 하였다. 이것은 관심있는 (게놈 통합) 유전자의 전사는 세포 성장률 (32)에 영향을 미치는 다양한 환경 스트레스 31 많은 요소가 제어으로 안정한 세포 클론의 공통적 인 특징이며, 세포주기 상태 33. 단일 FP 기반 geNOps는 따라서, NO는 • geNOp 발현 수준 1 형광 강도 증가의 손실을 유도 된 비 비율 적 프로브이며. 따라서, geNOps 신호 정규화는 특히 비교 분석시 세포 NO • 신호들을 정량화 필수적이다. 우리의 최근 연구 엄격한 선형 상관 (B)에 도시 된 바와 같이etween geNOps의 기저 형광 강도와 형광 농도의 넓은 범위에 걸쳐 NO • 유도 된 형광 소광의 강도는 1 밝혀졌다. 이 휴대 NO • 신호의 절대 정량 geNOps의 중요한 기능입니다. NOC-7에 대한 응답으로 그림 1의 G-geNOps 신호의 정상화에 도시 SNP는 HEK 세포를 차지하기 위해 자신의 능력에 관해서 다양하지 않은 것을 나타내는, 같은 판에서 다른 HEK 세포에서 균일 NO • 신호를 계시 그리고 NO • 기증자에서 유래 라디칼 NO • 저하. 반면, HeLa 세포에 사용 geNOps는 NOC-7에 대한 응답으로 다른 세포 중 세포 NO • 신호의 명확한 이질성을 보여 주었다. 이러한 차이는 세포의 생리와 병리에 여러 영향을 미칠 수 및 geNOp를 사용하여 발견 될 수있는 세포 유형 별 NO • 대사와 분해 속도를 가리의 기술.
그럼에도 불구하고, geNOps의 두 가지 중요한 기능은 센서와 데이터 해석의 올바른 사용을 위해 신중하게 고려되어야한다 : ⅰ) geNOps 적절한 철분을 필요로 (II) 완전히 NO • 1에 대응하고 ⅱ) FP 변형에 따라 geNOps는 수 1 민감한 pH를합니다. 여기에서 우리는 HEK, 헬라 또는 EA.hy926 세포 (프로토콜 2.6 참조) 중 하나에 표현된다 geNOps의 독성 철 (II) 보충에 적합한 것으로 밝혀졌다 프로토콜을 설명합니다. 이 철 세포 치료 (II) / 비타민 C는 세포 형태학, 세포 생존 및 셀 (1)의 대사 활동에 영향을 미치지 않았 음을 입증 하였지만, 다른 종류의 세포 및 조직이 중요한 단계를 최적화하는 것이 필수적 일 수도있다. 그러나, 일부 실험 조건에서, 철 (II)의로드 요구 geNOps의 적용을 제한 할 수있다. 특히, 이는 아스코르브가 N을 감소시킬 수 있음을 보여왔다O • 35 아스코르브 산염 철 (II) 단지는 37, 36 • NO 폐품을 할 수 있습니다. 또한, 과량의 철 (II) 및 아스코르브은 염증 반응 (39)와 커플 해제 된 eNOS (41)을 유도 할 수있다. 이러한 효과는 geNOps 기술을 사용할 때 고려되어야한다. 이는 특정 실험 조건 하에서 세포 내 pH를이 geNOps 형광 한 영향을 미칠 가능성이있는 34 크게 영향 것으로 나타났다. 특히, 시안과 녹색 geNOps 변형 산성화 1시 형광의 감소를 나타내는 민감한 상대적으로 pH가 있습니다. 산도 민감한 geNOps를 사용하는 경우 따라서, (부) 세포의 pH의 급성 변화는 거짓 NO의 • 신호를 시뮬레이션 할 수 있습니다. 음 contro 우리의 이전 작업, NO • 문자를 구분 geNOps의 병렬 사용 (geNOps의 MUT)에 제안LS는 pH가 1 변경에서 실제 휴대 NO • 신호를 해부하는 것이 좋습니다. 또한 세포의 pH 변화는 이러한 SypHer 34의 pH 프로브를 사용하여 검사 될 수있다.
또한, 우리는 내피 세포 대리 EA.hy926의 생리적 칼슘 -mobilizing 작용제에 대한 응답으로 내생 효소 NO • 형성을 시각화. EA.hy926 세포주는 지속적으로 38에서 eNOS 발현 자주 사용하는 모델 시스템이다. 일시적 EA.hy926 세포에서 발현 geNOps 사용하면, IP 3 칼슘 신호는 거의 L-NNA 의해 차단이 셀 타입에 깊은 NO • 형성 연상 – 매개 함을 확인 하였다. 시간적 NO • 신호와 칼슘 2를 상관하기 위해 G-geNOp 발현 세포는 UV-흥분성 화학 칼슘 지시등에의 Fura-2 / AM과 함께 로딩 하였다. 칼슘의 스펙트럼 분리 2+ 바운드 및 언 바운드은 Fura-2 FLUO G-geNOp rescence 신호로부터 쉽게 상업적으로 이용 가능한 필터 (40)를 세트로 얻을 수있다. 이미징 프로브 모두 칼슘 -triggered 효소 NO • 형성이 내피 세포 유형에서 세포 내 칼슘 증가에 비해 훨씬 느리다 발생 선보였다. 는 IP 3 -generating 작용제 브라 디 키닌과 세포 치료시 소 폐동맥에서 내피 세포의 단일 셀 NO • 신호의 유사 반응 속도뿐만 아니라 전단 응력을 사용하여보고 된 NOA-1, 간접 높은 NO • 민감한 센서 (12) . 따라서, 이들 데이터는 CA가 2+ 완전한 효소 활성에 도달 할 때까지 eNOS에 유래 NO • 형성이 소정의 개시 시간을 필요 -evoked 것을 강조한다. 셀룰러 NO • 형성, 확산 및 분해 반응 속도가 다른 데이터로부터 추출 될 수 있지만, NO •의 예 장력 계 측정은 혈관 이완 – 유도SS = "외부 참조"> (26), 형광 NO의 • 프로브의 가장 큰 장점은 그들이 직접 실시간으로 볼 수 신호로 휴대 NO • 변동을 변환하는 것입니다. 따라서, geNOps와 영상 휴대 NO의 • 신호는 높은 공간 및 시간 해상도를 제공하며, (부) 휴대 NO • 항상성을 조사하고 (재)에 고유 한 가능성을 제공합니다. 예를 들어, 영상 eNOS의 단일 내피 세포의 geNOps 기술과 함께 (42)를 왕복하는 효소 또는 칼 모듈 린과 카베 올린 (43)와 같은 다른 관련 단백질 -producing 아니오 •의 세포 내 현지화 및 전위와 NO • 형성의 상관 관계 없음 적합 할 수 있습니다.
여기에서 우리는 HEK 및 EA.hy926 세포가 기존의 넓은 필드 형광 m의 단일 세포 수준에서 실시간으로 생성 세포의 NO • 신호를 외생를 시각화하고 내생에 표현 G-geNOp의 실용적인 응용 프로그램을 설명icroscope. 우리의 데이터는 geNOps 특별히 흥미로운 세포 유형의 모든 종류를 사용하여 다양한 실험 조건 (하위) 셀룰러 NO • 역학을 추적하기에 적합한 것을 의미한다.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.
NaCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.20 | sodium chloride |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.1 | potassium chloride |
CaCl2 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T885.1 | calcium chloride dihydrate |
MgCl2 .6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | magnesium chloride hexahydrate |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.3 | 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8551.1 | sodium hydrogencarbonate |
KH2PO4 | Merck, Darmstadt, Germany | 104873 | potassium dihydrogen phosphate |
Na2HPO4 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.1 | sodium hydrogenphosphate dihydrate |
D(+)-Glucose monohydrate | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | >99.5%; for cell culture, endotoxin free; |
EGTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3054.2 | ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent |
NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6771.1 | sodium hydroxide |
HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4625.1 | hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N) |
DMSO | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | dimethyl sulfoxide; highly polar, aprotic organic solvent |
L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | G2128 | (S)-2-Aminoglutaric acid |
DMEM, low glucose | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | D5523 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
MEM Vitamin solution (100X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11120037 | 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
MEM Amino acids solution (50X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11130036 | 50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122.00 | antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures |
Amphotericin B | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15290026.00 | Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi |
FCS | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin |
PBS, pH 7.4 | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010031.00 | phosphate-buffered saline |
Fura-2 (AM) | Teflabs, Austin, TX, USA | 102 | fluorescent cytosolic calcium indicators |
Histamine dihydrochlorid | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | H7250 | 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist |
Nω-Nitro-L-arginine | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | N5501 | N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA; inhibitor of nitric oxide synthase |
NOC-7 | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 487952 | 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release |
Sodium nitroprusside dihydrate | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-203395A | sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound |
30-mm Cover slips | Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany | 41001130 | glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.) |
Iron(II) booster solution | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/ |
G-geNOp plasmid | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/ |
G-geNOp AAV5 | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/ |
G-geNOp sensor cell line | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/ |
HEK293A cell line | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R70507 | subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) |
EA.hy926 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany | CRL-2922 | somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549 |
TILL iMIC | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | digital microscope |
Polychrome V monochromator | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | ultra fast switching |
AVT Stingray F145B | Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany | n.a. | Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b |
alpha Plan Fluar 40 | Zeiss, Göttingen, Germany | n.a. | x40 objective |
dichroic filters | Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA | n.a. | GFP emitter 514/3 nm (515dcxr) |
ValveBank8 Controller | AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA | 01-08 | programmable perfusion system control unit |
BVC control | Vacuubrand, Wertheim, Germany | 727200 | Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system |
ImageJ software | NIH Image | Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome |