Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes
Summary
Het onderzoek naar membraanhandel is cruciaal voor het begrijpen van neuronale functies. Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit in neuronen. Dit is een handige methode die kan worden aangepast aan de kwantificering van membraanhandel in het zenuwstelsel.
Abstract
In de hersenen spelen membraanhandelstelsels belangrijke rol bij het reguleren van neuronale functies, zoals neuronale morfologie, synaptische plasticiteit, overleving en glialocommunicatie. Tot op heden hebben tal van studies gemeld dat defecten in deze systemen verschillende neuronale aandoeningen veroorzaken. Zo kan het begrijpen van de mechanismen die de vesiceldynamiek onderbouwen, invloedrijke aanwijzingen verschaffen die kunnen helpen bij de behandeling van meerdere neuronale stoornissen. Hier beschrijven we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteiten, zoals de beweeglijkheidsafstand en de snelheid van beweging, met behulp van een software plug-in voor het ImageJ-platform. Om afbeeldingen te verkrijgen voor kwantificering merken we neuronale endosoom-lysosoomstructuren met EGFP-getagde vesikelmarkerproteïnen en observeerde de beweging van blaasjes met behulp van een tijdverloopmicroscopie. Deze methode is zeer nuttig en vereenvoudigt het meten van vesikelmotiliteit in neurieten, zoals axonen en dendrieten, evenals in de som van beide neuronen en gliacellen. FurthermoOpnieuw, deze methode kan worden toegepast op andere cellijnen, zoals fibroblasten en endotheliale cellen. Deze aanpak zou een waardevolle bevordering kunnen bieden van ons begrip van membraanhandel.
Introduction
Een nauwkeurige controle van endosoom-lysosoomhandel is onontbeerlijk voor het reguleren van de neuronale functie. Met name de dynamische bewegingen van deze blaasjes zijn een belangrijke factor die de regulatie van neuronale morfologie, ontwikkeling en overleving onderstreept. Gebreken in dit systeem veroorzaken ernstige neuronale aandoeningen 1 , 2 . De moleculaire mechanismen die vesicale handel in neuronale aandoeningen vormen, worden beschouwd als ingewikkeld, en meerdere groepen hebben geprobeerd deze relevantie te onderzoeken. Er is bijvoorbeeld gemeld dat versteurde late endosomotiliteit significant is geassocieerd met Niemann-Pick C-ziekte 3 , een geërfde neurodegeneratieve stoornis veroorzaakt door lysosoomdefecten. Een ander voorbeeld is een mutatie in een lysosomaal Ca 2+ kanaal, trpml 1, waardoor de lysosomale motiliteit wordt aangetast, wat resulteert in lysosomale opslagziekten 4 , 5 , </Sup> 6 . Onze groep heeft gemeld dat dysregulatie van PtdIns (3,5) P 2 omzet de endosome en lysosome motiliteit in neuronen onderdrukt, wat leidt tot een toename van de kwetsbaarheid voor de stressrespons 7 , 8 . De metabolische regulering van PtdIns (3,5) P 2 , die meestal lokaliseert op late endosomen en lysosomen, speelt een belangrijke rol in een grote verscheidenheid aan cellulaire functies, waaronder vesikelhandel en fusie-splitsingsprocessen 9 , 10 . Aangezien de verminderde PtdIns (3,5) P 2 omzet ernstige neurodegeneratie 11 , 12 veroorzaakt , kan de afwijkende regulatie van endosome-lysosoommotiliteit een belangrijke factor zijn voor het begrijpen van de pathogenese van neurodegeneratie. Een onderzoek naar de moleculaire mechanismen die de vesicale motiliteit ten grondslag liggen, kunnen dus veelbelovende aanwijzingen verschaffen die onze unde kunnen verdiepenOpstanding van meerdere neuronale stoornissen.
In dit artikel introduceren we een waardevolle methode om de vesicale motiliteit in neuronen te kwantificeren met behulp van een gratis softwarepakket met de handmatige tracking. Het doel was om een snelle kwantificeringsmethode te ontwikkelen om vesikelmotiliteit te analyseren. Deze kwantificering is gericht op een standaardaanpak van het klikken op een referentiepunt in elk frame van een time-lapse film. Het gebruik van de Manual Tracking-software maakt deze aanpak vrij eenvoudig en van groot nut, in tegenstelling tot andere applicaties. Bovendien is deze aanpak ook van toepassing op andere cellen, zoals glialcellen. Hoewel deze methode primitief is, kan deze toegepast worden op verschillende analyses, waaronder cellulaire motiliteit en morfologische verandering. Bijvoorbeeld, na het definiëren van een referentiepunt over een reeks afbeeldingen, kan informatie over de posities van de referentiepunten en de tijd in elke positie worden geëxtraheerd uit sequentiële beelden met behulp van data analyse en beeldverwerking zachtware. Samenvattend is deze methode eenvoudig maar krachtig en draagt bij aan de ontwikkeling van verbeterde efficiëntie in studies op basis van membraanhandel, zoals die van endosoom-lysosoomfunctie onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol introduceert de procedure voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit. In primaire neuronen hebben endosomen en lysosomen de neiging om hoge motiliteit te tonen bij jongere neuronen (4-6 DIV). Aangezien neuronen bepaalde componenten aan de voorste randen moeten leveren om neurale processen te verlengen, moet membraanhandel dynamisch optreden tijdens dit stadium. Zo is het belangrijk om jongere neuronen te gebruiken om dynamische motiliteit in neuronale dendriten te waarnemen. Bovendien hebben grotere blaas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij bedanken dr. Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, huidige affiliatie: Novartis Institutes for Biomedical Research) om deze analyse te ontwikkelen en Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara en Dongsook Kim voor hun kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
- Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
- Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
- Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
- Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
- Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
- McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
- Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
- Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
- Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- . Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet] Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017)
- Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).
- Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).
- Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
- Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
- Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790 (2016).
- . Manual Tracking [Internet] Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual (2017)
- . ImageJ Tracking plug-in [Internet] Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017)
- Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
- Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).
- Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).
