Количественная оценка подвижности эндосомы и лизосом в культивируемых нейронах с помощью флуоресцентных зондов
Summary
Исследование переноса мембран имеет решающее значение для понимания функций нейронов. Здесь мы вводим метод количественного определения везикулярной подвижности в нейронах. Это удобный метод, который может быть адаптирован к количественной оценке переноса мембраны в нервной системе.
Abstract
В мозге системы переноса мембран играют важную роль в регулировании нейронных функций, таких как морфология нейронов, синаптичная пластичность, выживаемость и глиальные коммуникации. На сегодняшний день в многочисленных исследованиях сообщается, что дефекты в этих системах вызывают различные нейрональные заболевания. Таким образом, понимание механизмов, лежащих в основе динамики везикулы, может дать важные указания, которые могли бы помочь в лечении нескольких нейрональных нарушений. Здесь мы описываем метод количественной оценки везикулярных подвижностей, таких как дистанция подвижности и скорость движения, используя программный плагин для платформы ImageJ. Чтобы получить изображения для количественной оценки, мы пометили нейронные структуры эндосомно-лизосомы с EGFP-меченными везикулярными маркерными белками и наблюдали движение везикул с помощью микроскопии с интервалом времени. Этот метод очень полезен и упрощает измерение подвижности везикул в нейритах, таких как аксоны и дендриты, а также в соме как нейронов, так и глиальных клеток. FurthermoRe, этот метод может быть применен к другим клеточным линиям, таким как фибробласты и эндотелиальные клетки. Такой подход мог бы стать ценным прогрессом в нашем понимании переноса мембран.
Introduction
Точный контроль за оборотом эндосомных лизосом необходим для регуляции функции нейронов. Примечательно, что динамические движения этих везикул являются ключевым фактором, регулирующим морфологию, развитие и выживаемость нейронов. Дефекты в этой системе вызывают тяжелые нейрональные нарушения 1 , 2 . Молекулярные механизмы, связывающие перенос везикул с заболеваниями нейронов, считаются сложными, и несколько групп пытались изучить эту актуальность. Например, сообщалось, что нарушенная подвижность концевых эндосом значительно связана с болезнью Ниманна-Пика С 3 , наследственным нейродегенеративным расстройством, вызванным дефектами лизосомы. Другим примером является мутация в лизосомальном канале Ca 2+ , trpml 1, который нарушает лизосомальную подвижность, приводя к лизосомальным заболеваниям 4 , 5 , </Sup> 6 . Наша группа сообщила, что дисрегуляция оборота PtdIns (3,5) P 2 подавляет эндосому и подвижность лизосом в нейронах, что приводит к увеличению уязвимости к стрессовому ответу 7,8 . Метаболическая регуляция PtdIns (3,5) P 2 , которая главным образом локализуется на поздних эндосомах и лизосомах, играет важную роль в широком спектре клеточных функций, включая торможение пузырьков и процессы деления слиянием-делением 9 , 10 . Так как нарушение PtdIns (3,5) P 2 вызывает тяжелую нейродегенерацию 11 , 12 , аберрантная регуляция подвижности эндосом-лизосом может быть ключевым фактором для понимания патогенеза нейродегенерации. Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе везикулярной подвижности, может, таким образом, давать многообещающие подсказки, которые могут углубить наше undeВыявление нескольких нейрональных нарушений.
В этой статье мы представляем ценный метод для количественной оценки везикулярной подвижности в нейронах с использованием пакета бесплатного программного обеспечения под названием «Ручное отслеживание». Целью было разработать метод быстрого количественного анализа подвижности везикул. Эта количественная оценка направлена с использованием стандартного подхода при нажатии на опорную точку в каждом кадре видеоролика с замедленным воспроизведением. Использование программного обеспечения для ручного отслеживания делает этот подход довольно простым и имеет широкую функциональность, в отличие от других приложений. Кроме того, этот подход также применим к другим клеткам, таким как глиальные клетки. Хотя этот метод примитивен, его можно применять для различных анализов, в том числе в отношении подвижности клеток и морфологических изменений. Например, после определения опорной точки по последовательности изображений информация о положениях опорных точек и времени в каждой позиции может быть извлечена из последовательных изображений, используя анализ данных и мягкую обработку изображенийпосуда. В совокупности этот метод прост, но эффективен и способствует повышению эффективности исследований, основанных на переносе мембран, таких как исследование функции эндосомы-лизосомы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол вводит процедуру количественного определения везикулярной подвижности. В первичных нейронах эндосомы и лизосомы имеют тенденцию демонстрировать высокую подвижность в более молодых нейронах (4-6 DIV). Учитывая, что нейроны должны доставлять некоторые компоненты к передни?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Рикардо Долметша (Школа медицины Стэнфордского университета, нынешняя организация: Институты Новартис для биомедицинских исследований) за помощь в разработке этого анализа, а также доктора Мэтью Вуда, Такума Айхара и Донгсука Кима за их критическое чтение рукописи.
Materials
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
- Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
- Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
- Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
- Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
- Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
- McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
- Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
- Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
- Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- . Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet] Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017)
- Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).
- Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).
- Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
- Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
- Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790 (2016).
- . Manual Tracking [Internet] Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual (2017)
- . ImageJ Tracking plug-in [Internet] Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017)
- Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
- Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).
- Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).
