Kvantifiering av endosom och lysosommotiliteter i odlade neuroner med användning av fluorescerande probar
Summary
Utredningen av membranhandel är avgörande för att förstå neuronfunktioner. Här introducerar vi en metod för att kvantifiera vesikelmotilitet i neuroner. Detta är en bekväm metod som kan anpassas till kvantifieringen av membranhandel i nervsystemet.
Abstract
I hjärnan spelar membranhandelssystem viktiga roller för att reglera neuronfunktioner, såsom neuronal morfologi, synaptisk plasticitet, överlevnad och glial kommunikation. Hittills har många studier rapporterat att defekter i dessa system orsakar olika neuronala sjukdomar. Således kan förståelse av mekanismerna som ligger bakom vesikeldynamiken ge inflytelserika ledtrådar som kan hjälpa till vid behandling av flera neuronala störningar. Här beskriver vi en metod för att kvantifiera vesikelmotiliteter, såsom rörelseavstånd och rörelsehastighet, med hjälp av en plug-in för ImageJ-plattformen. För att erhålla bilder för kvantifiering märkte vi neuronala endosomlysosomstrukturer med EGFP-märkta vesikelmarkörproteiner och observerade rörelsen av vesiklar med hjälp av en tidsförlindningsmikroskopi. Denna metod är mycket användbar och förenklar mätning av vesikelmotilitet i neuriter, såsom axoner och dendriter, liksom i soma av både neuroner och glialceller. FurthermoÅterigen kan denna metod appliceras på andra cellinjer, såsom fibroblaster och endotelceller. Detta tillvägagångssätt skulle kunna ge en värdefull framsteg för vår förståelse av membranhandel.
Introduction
Exakt kontroll av endosomlysosomhandel är oumbärlig för att reglera neuronfunktionen. De dynamiska rörelserna hos dessa vesiklar är särskilt en nyckelfaktor som ligger bakom regleringen av neuronal morfologi, utveckling och överlevnad. Defekter i detta system orsakar allvarliga neuronala störningar 1 , 2 . De molekylära mekanismerna som knyter vesikelhandel till neuronala sjukdomar anses vara komplicerade, och flera grupper har försökt undersöka denna relevans. Det har till exempel rapporterats att perturbed late endosomotilitet är signifikant associerad med Niemann-Pick C-sjukdom 3 , en ärftlig neurodegenerativ sjukdom orsakad av lysosomfel. Ett annat exempel är en mutation i en lysosomal Ca2 + -kanal, trpml 1, vilket inverkar på lysosomal motilitet, vilket resulterar i lysosomala lagringssjukdomar 4 , 5 , </Sup> 6 . Vår grupp har rapporterat att dysregulering av PtdIns (3,5) P 2 omsättning undertrycker endosom och lysosomotilitet i neuroner vilket leder till en ökning av sårbarheten för stressresponsen 7 , 8 . Den metaboliska reglering av PtdIns (3,5) P 2 , som mestadels lokaliserar sig på sena endosomer och lysosomer, spelar en viktig roll i en mängd olika cellulära funktioner, inklusive vesikelhandel och fusionsfissionprocesser 9 , 10 . Eftersom nedsatt PtdIns (3,5) P 2 omsättning orsakar allvarlig neurodegeneration 11 , 12 , kan avvikande reglering av endosomlysosommotilitet vara en nyckelfaktor för att förstå patogenesen för neurodegenerering. En undersökning av de molekylära mekanismerna som ligger till grund för vesikelmotilitet kan således ge lovande ledtrådar som kan fördjupa vår undeRstanding av flera neuronala störningar.
I det här dokumentet introducerar vi en värdefull metod för att kvantifiera vesikelmotilitet i neuroner med ett gratis mjukvarupaket som heter Manual Tracking. Syftet var att utveckla en snabb kvantifieringsmetod för analys av vesikelmotilitet. Denna kvantifiering riktas genom en standardinriktning för att klicka på en referenspunkt i varje ram av en time-lapse-film. Användningen av Manual Tracking-mjukvaran gör att detta synsätt är ganska enkelt och brett, till skillnad från andra tillämpningar. Vidare är detta tillvägagångssätt även användbart för andra celler, såsom glialceller. Även om denna metod är primitiv kan den tillämpas på olika analyser, inklusive cellmotilitet och morfologisk förändring. Efter att ha definierat en referenspunkt över en sekvens av bilder kan information om positionerna för referenspunkterna och tiden vid varje position extraheras från sekventiella bilder med hjälp av dataanalys och bildbehandlingsmjukgods. Sammantaget är denna metod enkel men kraftfull och bidrar till utvecklingen av förbättrad effektivitet i studier baserade på membranhandel, såsom de som undersöker endosomlysosomfunktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll introducerar förfarandet för kvantifiering av vesikelmotilitet. I primära neuroner tenderar endosomer och lysosomer att visa hög motilitet hos yngre neuroner (4-6 DIV). Eftersom neuroner måste leverera vissa komponenter till de främre kanterna för att förlänga neurala processer, bör membranhandel ske dynamiskt under detta stadium. Således är det viktigt att använda yngre neuroner för att observera dynamisk motilitet i neuronaldenditer. Dessutom tenderar större vesiklar inte att uppvisa hö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, nuvarande anknytning: Novartis Institute for Biomedical Research) för att hjälpa till att utveckla denna analys och Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara och Dongsook Kim för deras kritiska läsning av manuskriptet.
Materials
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | Serum free medium |
| Hank's balanced salt solution | Thermo Fisher | 14170112 | |
| Penicilin Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 Supplements | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5% Trypsine | Thermo Fisher | 15090046 | |
| poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| Nylon cell strainer | Corning | 431750 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668027 | Transfection reagent |
| Polyethyleneimine "Max" | polysciences | 24765 | Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| Incubation system INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism version 6.0 | GraphPad Software | NA | |
| Excel version 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
References
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
- Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
- Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
- Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
- Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
- Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
- McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
- Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
- Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
- Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- . Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet] Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017)
- Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).
- Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).
- Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
- Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
- Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790 (2016).
- . Manual Tracking [Internet] Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual (2017)
- . ImageJ Tracking plug-in [Internet] Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017)
- Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
- Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).
- Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).
