IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델<em&gt; In Vivo</em&gt; 염증 반응의 장기 모니터링

요약

여기에 설명 된 방법은 비 침습적 bioluminescence 이미징 (BLI)을 통해 생쥐의 폐에서 IL-8 프로모터 의존 염증 활성화의 시각화 수 있습니다. 동일한 동물을 루시퍼 레이즈 리포터 구조물의 전달 시점으로부터 최대 2 개월 동안 BLI에 여러 번 투여 할 수있다.

초록

기도 염증은 세균 감염과 관련이 있으며 폐 질환의 주요 결정 인자입니다. 여러 요인의 염증 유발 능력을 생체 내에서 측정하는 것은 어려우며 기관지 폐포 세척 및 동일 장소 에서 종양 시각화를 배제한 현장 분석을위한 폐 제거와 같은 말단 절차가 필요합니다. 여기에서, 폐 염증은 이종 IL-8 bovine promoter의 조절하에 루시퍼 라 아제 리포터 유전자를 발현하는 transiently transgenized mice에서 Pseudomonas aeruginosa 배양 상등액 (SN)의 기관 내 점적을 통해 유도된다. 폐에서의 루시퍼 라제 발현은 점안 후 2.5-48 시간의 시간대 에 생체 내 생물 발광 이미지 (BLI) 분석에 의해 모니터링된다. 이 절차는 2 ~ 3 개월 이내에 여러 번 반복 할 수 있으므로 동일한 마우스에서 염증 반응을 평가할 수 있습니다동물을 해산 할 필요가있다. 이 접근법은 실시간으로 폐에서 작용하는 항 염증 인자의 모니터링을 허용하며, 기능적 및 약리학 적 연구에 적합하다.

서론

천식, 만성 폐색 성 폐 질환 (COPD), 낭포 성 섬유증 (CF) 및 기관지 확장증과 같은 만성 폐 질환은기도 염증을 특징으로합니다. 기도 염증은 부종, 세포 침투, T 임파구 및 비만 세포 활성화,기도 분비 증가 및 과도한 콜라겐 침착을 특징으로합니다. CF는 다 체계 장애로 사망률 및 이환율의 주요 원인은 폐 악화의 증가로 인한 폐 세균 감염입니다. 폐 기능의 저하는 결과 ^{1 , 2 , 3 , 4를} 예견한다.

호흡기의 염증 상태는 일반적으로 가래와 같은 하부기도와 상부기도로부터 유도 된 물질에서 염증 과정 동안 모집 된 면역 마커의 평가를 통해 관찰되며,ults. 기관지 내시경도 시행됩니다 ⁵ . Murine 모델은기도 염증으로 특징 지어지는 질병의 발병 기전과 진화를 조사하고 효과적인 치료법이나 치료법이 아직 밝혀지지 않은 유용한 도구입니다. 폐 감염과 염증의 동물 모델은 천식과 숙주 - 병원체 상호 작용을 연구하는데 사용되어왔다. 예를 들어, ....

프로토콜

기술 된 모든 동물 실험은 베로나 대학 (University of Verona)의 실험 연구 서비스 센터 (Interdepartmental Center of Experimental Research Service)의 동물 실험을위한 동물 실험을위한 교내 동물 복지위원회의 승인을 받았으며, European Directive 2010/63 UE, Italian D.Lgs 26/2014 및 개정 된 "실험실 동물의 관리 및 사용 안내서", 워싱턴 DC : National Academy Press, 1996.이 프로토콜과 실험은 국립 보건원 (National Institutes of Health) (n 273/15)의 승인을 받았습니다. 동물들은 표준 설치 동물과 연화 된 수돗물에 자유롭게 접근 할 수 있었으며 지역의 사료 조건 (실내 온도 : 20-24 ℃, 상대 습도 : 40-70 %, 명암주기 : 12 시간)에 적어도 5 일 동안 순응했다 ).

1. 생체 내 유전자 전달

1. 생체 내 전달 시약 / 핵산 복합체를 준비하려면 층류 후드를 사용하십시오.
2. 실험 프로토콜 정의하기제조업체의 생체 내 지시에 따라 매개 변수를 변경합니다.
   1. 마우스 당 복합체 2....

결과

bIL-8-Luc 일시적 형질 전환 마우스 모델은 분비 된 독성 인자를 함유하는 농축 된 박테리아 상등액 (30x)으로 항원 투여 된 마우스에서 폐 염증의 생체 내 모니터링을 위해 사용되었다. 유도 된 염증 반응은 BLI 신호의 증가로서 생체 내 이미징에 의해 검출 가능 하였다. BLI 시그널은 5 시간에서 24 시간 사이 최고 피크에 도달 했음에도 불구하고 프로 염증성 활성이 점안 후 2.5 시간에 명확하게 검출되었으며 48 시간 ( 그림 3 )에서 여전히 검출 가능했습니다.

도 3 : IL-8 일시적 형질 전환.......

토론

이전 연구 ¹¹ 에서 bIL-8-Luc 의존성 BLI와 BAL 마커 사이의 대조가 나타났다. 그것은 마우스 균주 내 민감도 차이에 의존했다. 이러한 이유 때문에 bIL-8-Luc 모델을 다른 마우스에 처음 적용하기 위해서는 BLI와 표준화 된 염증 표지자 모두에서 염증 반응에 대한 초기 연구가 필요합니다.

마우스 transfection은 경미한 폐 염증과 DNA 주입 후 3 ~ 4 일까지 BLI가 검출 할 수있는 bIL-8-Luc의 활성화를 유발합니다 ( 그림 4 ). 그런 다음 1 주일 후에 완전히 사라집니다. 유전자 전달 후 bIL-8-Luc의 발현은 생체 내 BLI에 의해 검증되어야하는데, 이는 다음 실험 단계의 성공을위한 필수 조건이기 때문입니다. 7 일 및 마우스 챌린지 이전에 기준선 활성화를 conf에 기록해야합니다형질 감염에 의해 유발 된 염증의 소멸을 확인하십시오.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
FMT 2500 형광 단층 촬영 시스템	Perkin Elmer Inc.	실험용 빌더
IVIS Lumina serie II 전임상 In Vivo; 이미징 시스템	Perkin Elmer Inc.	실험용 빌더
MMPsense 750 FAST	Perkin Elmer Inc.	NEV10001EX	빛으로부터 보호하고 프로브를 4°C에 보관하십시오. C
암컷 근친 교배 BalbC	Harlan Laboratories Italy		사용하기 전에, 동물들은 적어도 5 일 동안 현지 사육 조건
bIL-8-Luc 플라스미드	파르마		스미드를 -20 °에 저장; C
pGL3basic vector	Promega	E1751	벡터를 -20 °로 저장합니다. C
JetPEI DNA 형질주입 시약	Polyplus 형질주입	201B-001G	DNA와 JetPEI 혼합물은 7
D-루시페린 칼륨염 1 g	Perkin Elmer Inc.	122796	빛으로부터 보호하고 -20°C에서 보관하십시오. C
Living Image 소프트웨어	Caliper Life Sciences,Experimental	Builder
Isoflurane	ESTEVE spa	571329.8
Bio-Plex Cytokine Assay Kit	Bio-Rad Laboratories	M60-009RDPD	를 흡입하지 마십시오. C
자동 세포 계수기	Dasit XT 1800J	Experimental Builder
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator	Penn-century	DPM-EXT
가스 마취 시스템 XGI-8	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
PE190 마이크로 의료 튜브	2biological instruments snc	BB31695-PE/8
바늘 없는 주사기 5 mL	Terumo	SS*05SE1	가위로 피스톤 보드 자르기
Hamilton 0,10 mL (모델 1710)	Gastight	81022
Discofix 3-way Stopcock	Braun	4095111
Syringe with needle 1 mL	Pic 용액	3,071,260,300,320	바늘 없이 사용
플라스틱 공급 튜브 18ga x 50 mm	2biological instruments snc	FTP-18-50	팁을 비스듬히 자릅니다

에 순응했다 이탈리아 대학교 수의학과 플라의 최종 N/P 비율로 공식화되었습니다.