Un modelo de ratón IL-8 transgénicamente transgéni-<em> In Vivo</em> Monitoreo a Largo Plazo de las Respuestas Inflamatorias
Summary
El método descrito aquí permite la visualización de la activación de la inflamación dependiente del promotor de IL-8 en los pulmones de ratones a través de imágenes de bioluminiscencia no invasivas (BLI). El mismo animal puede ser sometido a BLI múltiples veces durante hasta dos meses a partir del momento de la entrega de la construcción de indicador de luciferasa.
Abstract
La inflamación de las vías respiratorias se asocia a menudo con infecciones bacterianas y representa un determinante principal de la enfermedad pulmonar. La determinación in vivo de las capacidades proinflamatorias de diversos factores es desafiante y requiere procedimientos terminales, como el lavado broncoalveolar y la extirpación de los pulmones para el análisis in situ , impidiendo la visualización longitudinal en el mismo ratón. Aquí, la inflamación pulmonar se induce a través de la instilación intratraqueal de sobrenadante de cultivo de Pseudomonas aeruginosa (SN) en ratones transgénicos transitoriamente expresando el gen indicador de luciferasa bajo el control de un promotor bovino heterólogo de IL-8. La expresión de luciferasa en el pulmón se monitoriza mediante análisis de imagen bioluminiscente in vivo (BLI) en un intervalo de tiempo de 2,5 a 48 h después de la instilación. El procedimiento puede repetirse varias veces dentro de 2 – 3 meses, permitiendo así la evaluación de la respuesta inflamatoria en los mismos ratones conLa necesidad de terminar con los animales. Este enfoque permite el monitoreo de factores pro y antiinflamatorios que actúan en el pulmón en tiempo real y parece adecuado para estudios funcionales y farmacológicos.
Introduction
Las enfermedades pulmonares crónicas, como el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis quística (fibrosis quística) y la bronquiectasia, se caracterizan por la inflamación de las vías respiratorias. La inflamación de las vías respiratorias se caracteriza por edema, infiltración celular, linfocitos T y activación de los mastocitos, aumento de las secreciones de las vías respiratorias y deposición excesiva de colágeno. La CF es un trastorno multisistémico, y su principal causa de mortalidad y morbilidad es la infección bacteriana pulmonar con aumento de la exacerbación pulmonar. La disminución de la función pulmonar predice un resultado significativamente peor 1 , 2 , 3 , 4 .
El estado inflamatorio del tracto respiratorio suele observarse a través de la evaluación de marcadores inmunológicos reclutados durante el proceso inflamatorio en material derivado de las vías respiratorias inferiores y superiores, como el esputo, que proporciona res variablesUlts. También se realizan broncoscopias 5 . Los modelos murinos son herramientas valiosas para investigar la patogénesis y la evolución de enfermedades caracterizadas por inflamación de las vías respiratorias y para las que aún no se han identificado tratamientos o curas eficaces. Se han utilizado modelos animales de infección pulmonar e inflamación para estudiar las interacciones entre el asma y el huésped, incluyendo el papel de los químicos que simulan las condiciones humanas ( por ejemplo, exposición al humo del cigarrillo, LPS, elastasa, ovalbúmina, poli I: C etc. Así como combinaciones de los anteriores) 6 . La medición de los parámetros relacionados con la inflamación requiere el sacrificio de los animales, ya que se requieren abordajes invasivos para medir factores tales como carga bacteriana, citocinas en los pulmones y líquido de lavado broncoalveolar (BAL) recogido. Además, a menudo se requieren exámenes histológicos. La posibilidad de obtener información sobre la cinética de respuesta inflamatoria requiere el uso deErous. Por lo tanto, una técnica que permita obtener dicha información sin la necesidad de sacrificar los animales es valiosa en bases técnicas, éticas, económicas y operativas.
La IL-8 es un agente esencial en el proceso inflamatorio, reclutando leucocitos al tejido inflamado. Representa una lectura molecular para el estudio de la activación de la vía inflamatoria. MIP-2 y KC pueden ser homólogos funcionales de IL-8 humana en ratones. Los ratones expresan sólo un potencial receptor de IL-8, un homólogo de CXCR2 humano 7 , 8 , pero son capaces de modular un promotor del gen de IL-8 heterólogo que conduce un gen reportero. Recientemente se ha desarrollado un modelo murino de inflamación pulmonar después de la observación de que un promotor de IL-8 bovino / reportero de luciferasa puede ser transactivado en ratones. Esta característica permite la utilización de imágenes de bioluminiscencia (BLI) para controlar la respuesta inflamatoria en la vida aNimals 9 .
Este modelo ha sido adaptado para estudiar la inflamación desencadenada por exoproductos bacterianos ( por ejemplo, LPS o productos liberados por cepas bacterianas) o TNFalfa 10 , 11 . El proceso de descubrimiento de fármacos se centra en el desarrollo y optimización de antiguas y nuevas moléculas anti-inflamatorias que pueden tratar enfermedades pulmonares, como la FC, el asma y la EPOC. Estas nuevas entidades químicas deben ser rápidamente y convenientemente probadas en modelos animales que pueden estar vinculados a fenotipos clínicos específicos con el fin de facilitar el diseño de ensayos clínicos inteligentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
En un trabajo previo 11 , se mostró un contraste entre los marcadores BLI y BAL dependientes de bIL-8-Luc. Se basó en el grado diferencial de sensibilidad dentro de cepas de ratón [ 12] . Por esta razón, la primera aplicación del modelo bIL-8-Luc a una cepa de ratón diferente requiere un estudio inicial de la respuesta inflamatoria, tanto en términos de BLI como de marcadores inflamatorios más estandarizados.
La transfección de ratones…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el FFC # 18/2013 de la Fundación de Fibrosis Quística de Italia, FFC # 29/2015 y por la Liga Italiana de Fibrosis Quística a través de la Rama de Veneto-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5ml | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 ml (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1ml | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
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