En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model för<em> In vivo</em> Långvarig övervakning av inflammatoriska reaktioner
Summary
Metoden som beskrivs här möjliggör visualisering av IL-8-promotorberoende inflammationsaktivering i lungorna hos möss genom icke-invasiv bioluminescensavbildning (BLI). Samma djur kan utsättas för BLI flera gånger i upp till två månader från tiden för leverans av luciferasreporterkonstruktionen.
Abstract
Luftvägsinflammation är ofta associerad med bakterieinfektioner och utgör en viktig determinant av lungsjukdomar. In vivo- bestämningen av de pro-inflammatoriska egenskaperna hos olika faktorer är utmanande och kräver terminala förfaranden, såsom bronko-alveolisk sköljning och avlägsnande av lungor för in situ- analys, vilket förhindrar longitudinell visualisering i samma mus. Här induceras lunginflammation genom intratracheal instillation av Pseudomonas aeruginosa- kultursupernatant (SN) i transientt transgeniserade möss som uttrycker luciferasreportergenen under kontroll av en heterolog IL-8 bovin promotor. Luciferasuttryck i lungan övervakas genom in vivo bioluminescerande bild (BLI) -analys över en 2,5- till 48-timmars tidsram efter instillationen. Förfarandet kan upprepas flera gånger inom 2-3 månader, vilket möjliggör utvärdering av det inflammatoriska svaret i samma möss medUt behovet av att säga upp djuren. Detta tillvägagångssätt tillåter övervakning av pro- och antiinflammatoriska faktorer som verkar i lungan i realtid och verkar lämpliga för funktionella och farmakologiska studier.
Introduction
Kroniska lungsjukdomar, såsom astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (COPD), cystisk fibros (CF) och bronkiektas, kännetecknas av luftvägsinflammation. Luftvägsinflammation kännetecknas av ödem, cellulär infiltration, T-lymfocyt- och mastcellsaktivering, ökade luftvägssekretioner och överdriven kollagenavsättning. CF är en multisystemstörning, och dess huvudsakliga orsak till mortalitet och sjuklighet är lungbakteriell infektion med ökad lungförstärkning. Nedgången i lungfunktionen förutsätter ett signifikant fattigare resultat 1 , 2 , 3 , 4 .
Inflammationstillståndet i andningsvägarna observeras vanligen genom utvärdering av immunologiska markörer som rekryteras under inflammatorisk process i material som härrör från nedre och övre luftvägar, såsom sputum, vilket ger varierande resÜLTS. Bronkoskopier utförs också 5 . Murine-modeller är värdefulla verktyg för att undersöka patogenesen och utvecklingen av sjukdomar som kännetecknas av luftvägsinflammation och för vilka effektiva behandlingar eller botemedel ännu inte har identifierats. Djurmodeller av lunginfektion och inflammation har använts för att studera interaktioner mellan astma och värdpatogen, inklusive kemikaliers roll som simulerar mänskliga förhållanden ( t.ex. exponering för cigarettrök, LPS, elastas, ovalbumin, poly I: C, etc. , som Såväl som kombinationer av ovanstående) 6 . Mätningen av inflammationsrelaterade parametrar kräver djurens offer, eftersom invasiva metoder krävs för att mäta faktorer som bakteriell belastning, cytokiner i lungorna och uppsamlad bronkoalveolär lavage (BAL) vätska. Dessutom krävs ofta histologiska undersökningar. Möjligheten att erhålla information om inflammatorisk responskinetik kräver användning av numEroserade möss. Därför är en teknik som skulle möjliggöra att erhålla sådan information utan att behöva offra djuren värdefull på tekniska, etiska, ekonomiska och operativa grunder.
IL-8 är en viktig aktör i inflammationsprocessen och rekryterar leukocyter till inflammerad vävnad. Det representerar en molekylär avläsning för studien av aktivering av inflammatorisk väg. MIP-2 och KC kan vara funktionella homologer av humant IL-8 hos möss. Möss uttrycker endast en potentiell IL-8-receptor, en homolog av human CXCR2 7,8 , men de är kapabla att modulera en heterolog IL-8-genpromotor som driver en reportergen. En murinmodell med lunginflammation har nyligen utvecklats efter det att en bovin IL-8-promotor / luciferas-reporterkonstruktion kan transaktiveras i möss. Denna funktion möjliggör användningen av bioluminescensavbildning (BLI) för att övervaka det inflammatoriska svaret vid lever aNimaler 9 .
Denna modell har anpassats för att studera inflammation utlöst av bakteriella exoprodukter ( t.ex. LPS eller produkter som frigörs av bakteriestammar) eller TNFalpha 10 , 11 . Läkemedelsupptäcktsprocessen är inriktad på utveckling och optimering av gamla och nya antiinflammatoriska molekyler som kan behandla lungsjukdomar, såsom CF, astma och KOL. Dessa nya kemiska enheter måste testas snabbt och bekvämt i djurmodeller som kan kopplas till specifika kliniska fenotyper för att underlätta utformningen av smarta kliniska prövningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
I ett tidigare arbete 11 visades en kontrast mellan bIL-8-Luc-beroende BLI- och BAL-markörer. Det förlitade sig på differentialgraden av känslighet inom musstammar 12 . Av den anledningen kräver den första applikationen av bIL-8-Luc-modellen till en annan musstam en initial studie av det inflammatoriska svaret, både när det gäller BLI och mer standardiserade inflammatoriska markörer.
Mösstransfektion orsakar mild lunginflammation och…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av det italienska Cystic Fibrosis Foundation Project FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 och av den italienska Cystic Fibrosis League genom Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta Cont la Fibrosi Cistica Onlus.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
| pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
| JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
| D-luciferin potassium salt 1g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5ml | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
| Hamilton 0,10 ml (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1ml | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18ga x 50mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
- Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
- Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
- Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
- Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
- Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
- Cacalano, G., et al. Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science. 265 (5172), 682-684 (1994).
- Simonet, W. S., et al. Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8. J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PLoS One. 7 (6), e39716 (2012).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS One. 9 (9), e106873 (2014).
