القوة الذرية المجهري التحقيقات من الحمض النووي الآفة الاعتراف في إصلاح ختان النوكليوتيدات
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
المجهر القوة الذرية (عفم) هو تقنية قوية لتحليل التفاعلات البروتين الحمض النووي 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 . وهو يتطلب كميات قليلة فقط من المواد عينة لتصور مباشرة عينات غير متجانسة مع قرار على مستوى جزيء واحد. يمكن أن ينتج عدم التجانس من مختلف حالات التوافقية أو أوليغوميريك من البروتين. على وجه الخصوص، في سياق عينات من الحمض النووي للبروتين، يمكن أن المجمعات البروتين عرض مختلف الكيمياء المتجانسة و / أو التوافق الناجم عن الحمض النووي ملزمة بشكل عام أو ملزمة لموقع مستهدف معين داخل الحمض النووي. قد تحتوي عينات غير متجانسة أيضا اثنين (أو أكثر) أنواع مختلفة من البروتينات، ومختلفة البروتين معقدةأشكال (على سبيل المثال ، تتكون من نوع واحد فقط من البروتين مقابل المجمعات هيتيروميريك) قد تتفاعل بشكل مختلف مع الحمض النووي. الدراسات التي نوقشت هنا استغلال التصوير عفم في الهواء على عينات ثابتة، المجففة من البروتينات إصلاح الحمض النووي إلى طويلة (~ 900 أزواج قاعدة، بي بي) شظايا الحمض النووي التي تحتوي على الآفة، وهو ما يمثل هدفا لهذه البروتينات. القرار الجزيئي العالي ل عفم يسمح بالتمييز بين أنواع مختلفة من المجمعات البروتينية وتحديد المواقف الملزمة للبروتينات على شظايا الحمض النووي. الأهم من ذلك، يتم إدخال الآفات في ركائز الحمض النووي في مواقف محددة جيدا. لأنه من المعروف موقع موقع الآفة في الحمض النووي، وتوزيعات البروتينات ملزمة على الحمض النووي توفر نظرة ثاقبة (مختلفة) خصائص التعرف على الآفات من (مختلف) المجمعات البروتين، على سبيل المثال ، مدى أنها تعترف نوع معين من الآفة (مقارنة إلى الحمض النووي غير التالفة) 2 ، 3 ، <supكلاس = "كريف"> 4 ، 5 ، 6 . مواقفهم على الحمض النووي تسمح أيضا التمييز بين المجمعات البروتين ملزمة على وجه التحديد في الآفات والمجمعات ملزمة غير محددة في أماكن أخرى على الحمض النووي. توصيف منفصل من هذه الأنواع المعقدة المختلفة (المجمعات المرتبطة تحديدا في الآفة مقابل المجمعات غير محددة) يمكن أن تكشف عن التغييرات التوافقية المحتملة في المجمعات التي يسببها تحديد الموقع المستهدف.
البروتينات إصلاح الحمض النووي التي تركز على هنا هي هيليكاسيس التي هي المسؤولة عن التعرف على الآفات في إصلاح ختان النوكليوتيدات (نر) المسار. في البكتيريا، ويتحقق نر من البروتينات أوفرا، أوفرب، و أوفرك. أوفرا هو المسؤول عن استشعار الآفة الأولية في أوفا 2 / أوفرب 2 الحمض النووي المسح الضوئي المعقدة. بعد التحقق من الآفة من قبل أوفرب تحول هذا المجمع إلى أوفرب أحادية الحد ملزمة في موقع الآفة وهذا المجمع المحدد يمكن بعد ذلك تجنيد pداء النواة النواة نونوكلياز نونوكلياز. أوفرك يكيس قصيرة (12-13 نت) تمتد من الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد (سدنا) التي تحتوي على الآفة. ثم يتم إعادة ملء المفقود من قبل البلمرة الحمض النووي. وأخيرا، دنا يغاز الأختام تمتد حديثا تمدد مع الحمض النووي الأصلي 9 ، 10 . في حقيقيات النوى، معظم البروتينات من سلسلة نر هي جزء من مجمع النسخ مولتيمريك كبير H H (تفيه) معقدة. بعد الآفة الأولية الاستشعار عن طريق مجمع CEN2-شيك-HR23B تريمي، يتم تعيين تفييه إلى موقع الهدف الحمض النووي. عندما شد داخل مجمع يتحقق من وجود آفة الهدف نر، يتم تعيين إندونوكليس نر حقيقية النواة النواة زغ و زف لاستئصال قصيرة (24-32 نت) تمتد من سدنا تحتوي على الآفة 9 ، 10 . هنا، على وجه التحديد، و هيليكاسيس أوفرب و شد من بدائية النواة و نر حقيقية النواة، على التوالي، ودرس. هذه هيليكاسيس تتطلب منطقة غير مزدحمة فيالحمض النووي (فقاعة الحمض النووي) لخيوط على واحد من اثنين من الحمض النووي فروع واحدة وترجمة بعد ذلك على طول هذا حبلا تغذيها أتب التحلل. بالإضافة إلى آفات الحمض النووي، وبالتالي تم إدخال فقاعة الحمض النووي في ركائز التي تعمل كموقع تحميل للبروتينات.
وقد وصف الإجراء لإعداد ركائز الحمض النووي الآفة محددة سابقا 11 . فإنه يتطلب بناء دنا دائري (البلازميد) مع اثنين من مواقع تقييد متباعدة عن كثب لنيكاز. في سياق هذه الدراسة، تم استخدام البلازميد pUC19N (2729 بي بي) (التي تم إنشاؤها بواسطة مختبر S. ويلسون، نيهس). هذا البلازميد يحتوي على ثلاثة مواقع تقييد متباعدة عن كثب ل Nt.BstNBI النيك التي تأطير 48 النيوكليوتيدات (نت) تمتد. بعد الحضانة مع نيكيس، يمكن إزالة امتداد سدنا بين هذه المواقع واستبدالها من قبل قليل النوكليوتيدات التي تحتوي على أي ميزة الهدف. بعد كل خطوة، يتم اختبار الهضم الأنزيمي الكامل عن طريق هلام الاغاروزالكهربائي. يمكن تمييز الحمض النووي دائري نيكيد بسبب انخفاض التنقل الكهربي مقارنة البلازميد سوبيركويلد الأصلي. ويمكن تقييم الفجوات من الحمض النووي واستبدال تمتد إزالتها من قبل قليل النوكليوتيد الركيزة محددة عن طريق الهضم مع انزيم تقييد الذي يحرض الركيزة حصرا داخل المنطقة بين النكات. ومن ثم سيتم قمع الخطي من البلازميد دائري من قبل الانزيم للحمض النووي المنبثق واستعادة بعد إدراج أوليغونكلأوتيد محددة. وأخيرا، فإن اثنين من مواقع تقييد نوكلياز داخلية (من الناحية المثالية القواطع واحدة) تسمح لتوليد الركيزة الحمض النووي الخطي، مع طول كما هو مطلوب ومع موقع الهدف المحدد في موقف محدد وكذلك فقاعة الحمض النووي على مسافة من الآفة إما في 5 'أو 3' الاتجاه.
التعرف على الآفات التي كتبها نيل هيليكاسيس يمكن التحقيق عن طريق التصوير عفم. توقفت الحمض النووي نقل من هيليكاسيس في رموقع الآفة مرئية كذروة في توزيع موقف البروتين على الحمض النووي ويشير إلى التعرف على الآفات. لأن نقل الحمض النووي لهذه هيليكاسيس هو علاوة على ذلك الاتجاه، مع 5 إلى 3 'قطبية، والاعتماد على الاعتراف الآفة على موقع موقع التحميل (فقاعة دنا المنبع أو المصب من الآفة) يشير أيضا إلى ما إذا كانت الآفة معترف بها بشكل تفضيلي على ترانزلاتوكاتد أو على العكس، غير ترانزلاتوكات سدنا حبلا 5 ، 9 . في الأقسام التالية، سيتم عرض الأساليب المستخدمة وسيتم مناقشة النتائج الرئيسية من هذه التجارب بإيجاز. الأهم من ذلك، على غرار العمل المثالي على إصلاح الحمض النووي هو مبين هنا، والتصوير عفم يمكن تطبيقها على دراسة مختلف النظم المتفاعلة الحمض النووي، مثل تكرار الحمض النووي أو النسخ 8 و 12 و 13 و 14 </سوب>.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليلات إحصائية عفم من المواقف ملزمة من البروتينات على شظايا الحمض النووي طويلة التي تحتوي على مواقع مستهدفة محددة يمكن أن تكشف عن تفاصيل مثيرة للاهتمام حول الاستراتيجيات المحددة المستخدمة من قبل البروتين للتعرف على هذه المواقع 2 ، 3 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUC19N، أوليغونوكلأوتيدس التي تحتوي على كبد، و p44 تم توفيرها من قبل صمويل ويلسون، كوربينيان هيل وتوماس كاريل، و غودرون ميشلز وكارولين كيسكر، على التوالي. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من دويتشه فورسشونغزجيمينشافت (دفغ) FZ82 و تي-671/4 لتكنولوجيا المعلومات.
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
References
- Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
- Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
- Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
- Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
- Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
- Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
- Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
- Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. 생화학. 51, 1500-1509 (2012).
- Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
- Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
- Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
- Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
- Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
- Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2012).
- Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
- Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
- Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
- Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
- Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
- Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
- Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
- Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
- Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
- Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
- Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
- Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).
