Microscopie de la force atomique Enquêtes sur la reconnaissance des lésions de l'ADN dans la réparation de l'excision des nucléotides
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
La microscopie à force atomique (AFM) est une technique puissante pour l'analyse des interactions protéine-ADN 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Il ne nécessite que de faibles quantités de matériel d'échantillonnage pour visualiser directement des échantillons hétérogènes avec une résolution au niveau de la molécule unique. L'hétérogénéité peut résulter de différents états conformationnels ou oligomères d'une protéine. En particulier, dans le contexte des échantillons de protéines-ADN, les complexes de protéines peuvent présenter différentes stœchiométries et / ou conformations induites par la liaison de l'ADN en général ou se liant à un site cible spécifique dans l'ADN. Les échantillons hétérogènes peuvent également contenir deux (ou plus) différents types de protéines et différents complexes de protéinesLes formes ( par exemple , constituées d'un seul type de protéines par rapport aux complexes hétéromères) peuvent interagir différemment avec l'ADN. Les études décrites ici exploitent l'imagerie AFM dans l'air sur des échantillons statiques et secs de protéines de réparation d'ADN liées à des fragments d'ADN longs (~ 900 paires de bases, pb) qui contiennent une lésion, ce qui représente une cible de ces protéines. La haute résolution moléculaire de l'AFM permet la distinction entre différents types de complexes de protéines et de déterminer les positions de liaison des protéines sur les fragments d'ADN. Fait important, les lésions sont introduites dans les substrats d'ADN à des positions bien définies. Étant donné que la position du site de lésion dans l'ADN est connue, les distributions de protéines liées à l'ADN donnent un aperçu des propriétés (différentes) de reconnaissance de lésion des complexes protéiques (différents), par exemple , à quel point ils reconnaissent un type particulier de lésion (comparé À l'ADN non endommagé) 2 , 3 , <supClass = "xref"> 4 , 5 , 6 . Leurs positions sur l'ADN permettent également la distinction entre les complexes de protéines liés spécifiquement aux lésions et aux complexes liés de manière non spécifique ailleurs sur l'ADN. La caractérisation séparée de ces différents types complexes (complexes liés spécifiquement à la lésion par rapport aux complexes non spécifiques) peut révéler des changements de conformation potentiels dans les complexes induits sur l'identification du site cible.
Les protéines de réparation d'ADN ciblées ici sont des hélicases qui sont responsables de la reconnaissance de lésion dans la voie de la réparation de l'excision nucléotidique (NER). Dans les bactéries, le NER est atteint par les protéines UvrA, UvrB et UvrC. UvrA est responsable de la détection initiale des lésions dans un complexe d'analyse d'ADN UvaA 2 / UvrB 2 . Lors de la vérification de la lésion par UvrB, ce complexe se convertit en UvrB monomérique lié au site de la lésion et ce complexe spécifique peut alors recruter le pEndonucléase NER rokaryote UvrC. UvrC excise un tronçon court (12-13 nt) d'ADN monocaténaire (ssDNA) contenant la lésion. L'étirement manquant est ensuite rempli par l'ADN polymérase. Enfin, l'ADN ligase scelle l'étirement nouvellement synthétisé avec l'ADN original 9 , 10 . Dans les eucaryotes, la plupart des protéines de la cascade de NER font partie du grand complexe de facteur de transcription multimérique II H (TFIIH). Après la détection initiale des lésions via le complexe trimerique CEN2-XPC-HR23B, TFIIH est recruté sur le site cible de l'ADN. Lorsque XPD dans le complexe vérifie la présence d'une lésion cible NER, les endocontases NER Eucaryotes XPG et XPF sont recrutés pour acciser un tronçon court (24-32 nt) d'ADN ssD contenant la lésion 9 , 10 . Ici, plus précisément, les hélicases UvrB et XPD provenant du NER procaryote et eucaryote, respectivement, ont été étudiés. Ces hélicases nécessitent une région non appauvrieL'ADN (une bulle d'ADN) pour filer sur l'un des deux filaments simples d'ADN et ensuite translater le long de ce brin alimenté par l'hydrolyse ATP. En plus des lésions d'ADN, une bulle d'ADN a donc été introduite dans les substrats qui fonctionnent comme site de chargement pour les protéines.
La procédure de préparation de substrats spécifiques d'ADN de lésion a été décrite précédemment 11 . Il nécessite une construction d'ADN circulaire (plasmide) avec deux sites de restriction étroitement espacés pour une nickase. Dans le cadre de cette étude, le plasmide pUC19N (2729 pb) a été utilisé (créé par le laboratoire de S. Wilson, NIEHS). Ce plasmide contient trois sites de restriction étroitement espacés pour la nickase Nt.BstNBI qui encadrent un étirement de 48 nucleotides (nt). Après incubation avec la nickase, le tronçon de ssDNA entre ces sites peut être éliminé et remplacé par un oligonucléotide contenant toute caractéristique cible. Après chaque étape, la digestion enzymatique complète est testée via un gel d'agaroseÉlectrophorèse. On peut distinguer l'ADN circulaire nickel en raison de sa mobilité électrophorétique inférieure par rapport au plasmide super-enroulé d'origine. Le dégagement de l'ADN et le remplacement de l'étirement enlevé par l'oligonucléotide spécifique du substrat peuvent être évalués par digestion avec une enzyme de restriction qui incarne le substrat exclusivement dans la région entre les nicks. La linéarisation du plasmide circulaire par l'enzyme sera donc supprimée pour l'ADN gapped et restaurée après insertion de l'oligonucléotide spécifique. Enfin, deux sites de restriction d'endonucléase (idéalement des coupeurs individuels) permettent la génération d'un substrat d'ADN linéaire, avec la longueur souhaitée et avec le site cible spécifique à une position définie ainsi qu'une bulle d'ADN à distance de la lésion soit en 5 'Ou 3' direction.
La reconnaissance des lésions par les hélicases NER peut être étudiée par imagerie AFM. Transfert d'ADN bloqué des hélicases à tLe site de lésion est visible comme un pic dans la distribution de la position de la protéine sur l'ADN et indique la reconnaissance de la lésion. Parce que la translocation de l'ADN de ces hélicases est en outre directionnelle, avec une polarité de 5 'à 3', la dépendance de la reconnaissance de la lésion sur la position du site de chargement (bulle d'ADN en amont ou en aval de la lésion) indique également si la lésion est préférentiellement reconnue Sur le brin translaté ou inversé, non translaté, ssDNA 5 , 9 . Dans les sections suivantes, les méthodes utilisées seront introduites et les résultats majeurs de ces expériences seront discutés brièvement. Il est important de noter que l'imagerie AFM peut être appliquée à l'étude de différents systèmes d'interaction de l'ADN, tels que la réplication ou la transcription de l'ADN 8 , 12 , 13 , 14 , analogue au travail exemplaire sur la réparation de l'ADN . </Sup>.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les analyses statistiques AFM des positions contraignantes des protéines sur des fragments d'ADN longs qui contiennent des sites cibles spécifiques peuvent révéler des détails intéressants sur les stratégies particulières employées par la protéine pour reconnaître ces sites 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Pour interpréter les distributions de position ré…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUC19N, des oligonucléotides contenant du CPD et p44 ont été fournis par Samuel Wilson, Korbinian Heil et Thomas Carell, et Gudrun Michels et Caroline Kisker, respectivement. Ce travail a été soutenu par des subventions de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 et TE-671/4 à IT.
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
References
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