न्यूक्लियोटाइड एक्साइज मरम्मत में डीएनए घाव पहचान की परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जांच
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) प्रोटीन-डीएनए 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। एकल अणु स्तर पर एक संकल्प के साथ विषम नमूनों को सीधे विज़ुअलाइज़ करने के लिए केवल नमूना सामग्री की कम मात्रा की आवश्यकता होती है। विविधता एक प्रोटीन के विभिन्न गठनात्मक या ओलिगोमोरिक राज्यों से उत्पन्न हो सकती है। विशेष रूप से, प्रोटीन-डीएनए नमूनों के संदर्भ में, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स डीएनए बाध्यकारी द्वारा डीएनए के भीतर एक विशिष्ट लक्ष्य साइट के लिए अलग-अलग स्टिइचीमेट्रिक्स और / या डीएनए बाध्यकारी द्वारा प्रेरित प्रदर्शनों को प्रदर्शित कर सकते हैं। विषम नमूने में भी दो (या अधिक) विभिन्न प्रकार के प्रोटीन, और विभिन्न प्रोटीन जटिल शामिल हो सकते हैंरूपों ( उदाहरण के लिए , केवल एक प्रकार की प्रोटीन बनाम हेटेरोमेरिक कॉम्प्लेक्स) डीएनए के साथ अलग तरह से बातचीत कर सकते हैं। यहां पर चर्चा किए गए अध्ययन में लंबे समय से (~ 900 बेस जोड़े, बीपी) डीएनए टुकड़े जो कि इन प्रोटीनों के लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं, एक घाव है, के लिए बाध्य डीएनए की मरम्मत प्रोटीन के स्थैतिक, सूखे नमूनों पर हवा में AFM इमेजिंग का फायदा उठाते हैं। एएफएम के उच्च, आणविक संकल्प, विभिन्न प्रकार के प्रोटीन परिसरों के बीच अंतर और डीएनए टुकड़ों पर प्रोटीनों की बाध्यकारी स्थिति निर्धारित करने की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण रूप से, घावों को डीएनए सबस्ट्रेट्स में अच्छी तरह से परिभाषित स्थानों पर पेश किया जाता है। क्योंकि डीएनए में घाव साइट की स्थिति ज्ञात है, डीएनए पर बाध्य प्रोटीन के वितरण से (अलग) प्रोटीन परिसरों के (अलग-अलग) घाव मान्यता गुणों में अंतर्दृष्टि प्रदान होती है, उदाहरण के लिए , वे एक विशेष प्रकार के घावों की पहचान कैसे करते हैं (तुलना गैर-क्षतिग्रस्त डीएनए) 2 , 3 , <supवर्ग = "xref"> 4 , 5 , 6 डीएनए पर उनकी स्थिति डीएनए पर मौजूद अन्य जगहों पर विशेष रूप से घावों और परिसरों पर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के बीच अंतर की अनुमति देती है। इन भिन्न जटिल प्रकारों (विशेष रूप से घाट बनाम गैर विषैले परिसरों पर परिसर के संकुचित) के अलग-अलग लक्षण वर्णन लक्ष्य साइट पहचान पर प्रेरित परिसरों में संभावित गठनात्मक परिवर्तनों को प्रकट कर सकते हैं।
डीएनए की मरम्मत प्रोटीन यहां पर केंद्रित हैं जो कि न्यूक्लियोटाइड छपाई की मरम्मत (एनईआर) मार्ग में घाव की पहचान के लिए जिम्मेदार हैं। बैक्टीरिया में, एनईआर प्रोटीन यूवीआरए, यूवीआरबी और यूवीआरसी द्वारा प्राप्त किया जाता है। यूवाआरए यूवाए 2 / यूवीआरबी 2 डीएनए स्कैनिंग कॉम्प्लेक्स में प्रारंभिक घावों के लिए जिम्मेदार है। यूवीआरबी द्वारा घाव सत्यापन पर यह जटिल घाव स्थल पर बंधे हुए मोनोमेरिक यूवीआरबी में धर्मान्तरित होता है और इस विशिष्ट परिसर में पीआरकोरीओटीक एनईआर एंडोन्युक्लेईज यूवीआरसी यूवीआरसी एकल फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) के घावों वाले एक छोटे (12-13 एनटी) खंड को बढ़ाता है। लापता खंड फिर डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा refilled है अंत में, डीएनए लैगेज मूल डीएनए 9 , 10 के साथ नए संश्लेषित खंड को जवानों में लगाया जाता है। यूकेरियोट्स में, एनईआर कैस्केड के अधिकांश प्रोटीन बड़े, बहुप्रवर्तक प्रतिलेखन कारक II एच (टीएफआईआईएच) जटिल का हिस्सा हैं। त्रिआमी सीएन 2-एक्सपीसी-एचआर 23 बी कॉम्प्लेक्स के माध्यम से प्रारंभिक घावों के बाद, टीएफआईआईएच को डीएनए लक्ष्य साइट पर भर्ती किया जाता है। जब परिसर में एक्सपीड एक एनईआर लक्ष्य घाव की उपस्थिति का सत्यापन करता है, तो यूकेरियोटिक एनईआर एंडोन्यूक्लूसियस एक्सपीजी और एक्सपीएफ को एसएसडीएनए के एक छोटे (24-32 एनटी) खंड को उत्पादित किया जाता है जिसमें घाव 9 , 10 होता है । यहां, विशेष रूप से, प्रोकोरियोटिक और यूकेरियोटिक एनईआर से क्रमशः यूवीआरबी और एक्सपीडी का अध्ययन किया गया। इन helicases में एक unpaired क्षेत्र की आवश्यकता होती हैडीएनए (एक डीएनए बुलबुला) दो डीएनए एकल किलों में से एक पर धागा और बाद में एटीपी जलविद्युत द्वारा प्रेरित इस किनारा पर अनुवाद करें। डीएनए घावों के अतिरिक्त, एक डीएनए बुलबुला इसलिए substrates में पेश किया गया था जो प्रोटीन के लिए लोडिंग साइट के रूप में कार्य करता है।
विशिष्ट घाव डीएनए सबस्ट्रेट्स की तैयारी की प्रक्रिया को पहले 11 वर्णित किया गया है इसके लिए एक परिपत्र डीएनए (प्लास्मिड) की आवश्यकता है जिसमें एक निकेस के लिए दो करीबी स्थान प्रतिबंध साइटों की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन के संदर्भ में, प्लाज्मिड पीयूसी 1 9 एन (2729 बीपी) का इस्तेमाल किया गया (एस विल्सन की प्रयोगशाला, एनआईईएचएस द्वारा बनाई गई)। इस प्लास्मिड में निकेस एनटी। बीएसटीएनबीआई के लिए करीब तीन दूरी पर प्रतिबंध लगाने वाली साइटें हैं, जो कि 48 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) खंड के फ्रेम में हैं। निकेस के साथ ऊष्मायन के बाद, इन साइटों के बीच एसएसडीएनए के खंड को हटाया जा सकता है और किसी भी लक्ष्य सुविधा वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। प्रत्येक चरण के बाद, एंजाइमैटिक पाचन पूरी तरह से agarose जेल के माध्यम से परीक्षण किया जाता हैवैद्युतकणसंचलन। मूल सुपरकोइल प्लाज्मिड की तुलना में निचले इलेक्ट्रॉफ़ोरेटिक गतिशीलता के कारण निकी परिपत्र डीएनए को अलग किया जा सकता है। विशिष्ट सब्सट्रेट oligonucleotide द्वारा हटाए गए खंड के डीएनए और प्रतिस्थापन के प्रतिस्थापन एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ पाचन के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है जो सिक्सस्ट्रेट को विशेष रूप से एनिक्स के बीच के क्षेत्र में फैलता है। एंजाइम द्वारा परिपत्र प्लाज्मिड का रेखीयकरण इसलिए विशिष्ट डीएनए के लिए दबा दिया जाएगा और विशिष्ट ओलिगोनक्लियोटाइड को सम्मिलित करने के बाद बहाल किया जाएगा। अंत में, दो एंडोन्यूसाइट प्रतिबंध साइटें (आदर्श रूप से एकल कटर) एक रेखीय डीएनए सब्सट्रेट की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं, लंबाई के साथ वांछित होती है और निश्चित लक्ष्य साइट पर और साथ ही डीएनए बुलबुले भी घावों से दूरी पर 5 में 'या 3' दिशा
एनईआर हेलिसेज़ द्वारा घावों की पहचान एएफएम इमेजिंग द्वारा जांच की जा सकती है। टी में हेलिसिजों का स्थाई डीएनए स्थानांतरवह घाव साइट डीएनए पर प्रोटीन की स्थिति के वितरण में शिखर के रूप में दिखाई देता है और घाव मान्यता को इंगित करता है। क्योंकि इन हेलिसेज़ों के डीएनए ट्रांसपोर्लेशन 5'-ते-3 'ध्रुवीकरण के साथ दिशात्मक है, लोडिंग साइट (डीएनए बबल अपस्ट्रीम या घावों से नीचे की ओर) की स्थिति पर घाव की मान्यता पर निर्भर करता है यह भी इंगित करता है कि क्या घाव को प्राथमिकता से मान्यता प्राप्त है अनुवादित या विपरीत, गैर अनुवादित एसएसडीएनए किनारा 5 , 9 पर निम्नलिखित खंडों में, इस्तेमाल किए जाने वाले तरीके पेश किए जाएंगे और इन प्रयोगों से प्रमुख निष्कर्षों पर संक्षेप में चर्चा की जाएगी। महत्वपूर्ण रूप से, यहां दिखाए गए डीएनए की मरम्मत पर अनुकरणीय कार्य के समान, एएमएएम इमेजिंग डीएनए प्रतिकृति या ट्रांसक्रिप्शन 8 , 12 , 13 , 14 जैसे विभिन्न डीएनए बातचीत प्रणालियों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है </sup>।
Protocol
Representative Results
Discussion
एएमएएम के सांख्यिकीय विश्लेषण में लंबे समय से डीएनए के टुकड़े पर प्रोटीन के विशिष्ट स्थानों का पता लगाया जा सकता है, जो इन साइटों 2 , 3 , 4 , 5 , 6 क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
पीयूसी19 एन, सीपीडी युक्त ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, और पी 44 को क्रमशः शमूएल विल्सन, कोरबिनियन हेइल और थॉमस कैरेल और गुडरुन मिशेल और कैरोलीन किस्कर द्वारा प्रदान किया गया था। इस काम को ड्यूश फोर्सचुंगस्सेमिंस्काफ्ट (डीएफजी) एफजे 82 और ते -671 / 4 से आईटी के अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
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