ヌクレオチド切除修復におけるDNA損傷認識の原子間力顕微鏡検査
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
原子間力顕微鏡（AFM）は、タンパク質-DNA相互作用1,2,3,4,5,6,7,8,9の解析に強力な技術です。単一分子レベルの分解能で異種試料を直接視覚化するには、少量の試料材料しか必要としない。異種性は、タンパク質の異なる立体配座またはオリゴマー状態から生じ得る。特に、タンパク質-DNA試料に関しては、タンパク質複合体は、一般にDNA結合によって誘導されるか、またはDNA内の特定の標的部位に結合する異なる化学量論および/またはコンホメーションを示すことができる。異種試料はまた、2種類（またはそれ以上）の異なる種類のタンパク質および異なるタンパク質複合体形態（ 例えば 、1つのタイプのタンパク質対ヘテロメリック複合体のみからなる）はDNAと異なって相互作用することができる。ここで論じた研究は、これらのタンパク質の標的を表す病変を含む長い（約900塩基対、bp）DNA断片に結合したDNA修復タンパク質の静的乾燥サンプルの空気中でのAFMイメージングを利用する。 AFMの高い分子分解能は、異なるタイプのタンパク質複合体の間の区別を可能にし、DNA断片上のタンパク質の結合位置を決定する。重要なことに、病変は、明確な位置でDNA基質に導入される。 DNA中の病変部位の位置は既知であるので、DNAに結合したタンパク質の分布は、（異なる）タンパク質複合体の（異なる）病変認識特性、 例えばそれらが特定のタイプの病変をどれくらいよく認識するか（ 例えば 、非損傷DNAに対する） <supclass = "xref"> 4,5,6。 DNA上のそれらの位置はまた、病変部に特異的に結合したタンパク質複合体とDNA上の他の場所に非特異的に結合した複合体との区別を可能にする。これらの異なる複合型（病変部と非特異的複合体に特異的に結合した複合体）の別個の特徴付けは、標的部位の同定に誘導された複合体における立体配座変化を明らかにする可能性がある。
ここで焦点を当てたDNA修復タンパク質は、ヌクレオチド切除修復（NER）経路における病変認識の原因となるヘリカーゼである。細菌では、NERはタンパク質UvrA、UvrBおよびUvrCによって達成される。 UvrAは、UvaA 2 / UvrB 2 DNAスキャン複合体における初期病変感知の原因である。 UvrBによる病変確認の際、この複合体は病変部位で結合した単量体UvrBに変換され、この特定の複合体はp原核生物NERエンドヌクレアーゼUvrC。 UvrCは、病変を含む一本鎖DNA（ssDNA）の短い（12-13nt）ストレッチを切除する。失われたストレッチは、DNAポリメラーゼによって再充填される。最後に、DNAリガーゼは新しく合成されたストレッチを元のDNA 9,10 で密封する。真核生物では、NERカスケードの大部分のタンパク質は、大きな多量体転写因子II H（TFIIH）複合体の一部である。三量体CEN2-XPC-HR23B複合体による初期病変感知の後、TFIIHをDNA標的部位に補充する。複合体内のXPDがNER標的病変の存在を確認すると、真核生物のNERエンドヌクレアーゼXPGおよびXPFが病変を含むssDNAの短い（24〜32nt）ストレッチを切除するために補充される9,10 。ここでは、具体的には、原核生物および真核生物NER由来のヘリカーゼUvrBおよびXPDをそれぞれ研究した。これらのヘリカーゼは、2つのDNA一本鎖のうちの1つに糸を通し、続いてATP加水分解によってこの鎖に沿って転位するDNA（DNAバブル）。したがって、DNA損傷に加えて、DNAバブルが、タンパク質の負荷部位として機能する基質に導入された。
特異的病変DNA基質の調製手順は以前に記載されている11 。それは、ニカナーゼのための2つの密接に隔てられた制限部位を有する環状DNA構築物（プラスミド）を必要とする。この研究の文脈では、プラスミドpUC19N（2729bp）を使用した（S. Wilsonの実験室、NIEHSによって作製された）。このプラスミドは、48ヌクレオチド（nt）のストレッチを構成するニカナーゼNt.BstNBIの3つの密接に隔てられた制限部位を含む。ニカナーゼとのインキュベーション後、これらの部位間のssDNAのストレッチを除去し、任意の標的特性を含むオリゴヌクレオチドで置き換えることができる。各工程の後、完全な酵素消化をアガロースゲル電気泳動。ニッキングされた環状DNAは、元のスーパーコイルプラスミドと比較してその電気泳動移動度が低いために区別することができる。 DNAのギャップ付けおよび除去されたストレッチの特定の基質オリゴヌクレオチドによる置換は、基質のみをニックの間の領域内で切断する制限酵素による消化によって評価することができる。したがって、酵素による環状プラスミドの直線化は、ギャップを有するDNAについて抑制され、特異的オリゴヌクレオチドの挿入後に回復する。最後に、2つのエンドヌクレアーゼ制限部位（理想的には単一のカッター）は、線状DNA基質の生成を可能にし、長さは所望の通りであり、特定の標的部位と定義された位置にDNA泡があり、 'または3'方向。
NERヘリカーゼによる病変の認識は、AFMイメージングによって調べることができる。 tにおけるヘリカーゼのDNA転位の停止病変部位は、DNA上のタンパク質位置分布のピークとして見え、病変認識を示す。これらのヘリカーゼのDNA転位はさらに5 'から3'の極性で方向性があるため、装填部位（病変の上流または下流のDNAバブル）の位置に対する病変認識の依存性も病変が優先的に認識されるかどうかを示す転位されたまたは反対の、非転座のssDNA鎖5,9。以下のセクションでは、使用される方法が紹介され、これらの実験からの主要な所見が簡単に議論される。重要なことに、ここに示すDNA修復の例示的な研究に類似して、AFMイメージングは、DNA複製または転写などの異なるDNA相互作用系の研究に適用することができる8,12,13,14 </。
Protocol
Representative Results
Discussion
特定の標的部位を含む長いDNA断片上のタンパク質の結合位置のAFM統計分析は、これらの部位2,3,4,5,6を認識するためにタンパク質が用いる特定の戦略に関する興味深い詳細を明らかにすることができる。得られた位置分布を解釈するために、DNA中の標的の位置を正確に知る必要がある。これは、明確な配列位置に特異的部位を環状プラスミドDNAに導入し、この特異的部位を含むDNAの断片を制限?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUC19N、CPD含有オリゴヌクレオチド、およびp44は、Samuel Wilson、Korbinian HeilおよびThomas Carell、およびGudrun MichelsおよびCaroline Kiskerによりそれぞれ提供された。この研究は、ドイツForschungsgemeinschaft（DFG）FZ82およびTE-671/4からITへの助成金によって支えられました。
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
References
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