Summary

Воздействие на ЦНС Pig для гистологического анализа: Руководство для обезглавливания черепа Открытие и Brain Removal

Published: April 13, 2017
doi:

Summary

Цель данной статьи и обучающего видео, чтобы описать, как выявить и удалить посмертную свинью мозг и гипофиз в интактном состоянии, подходящем для последующего макроскопического и гистологического анализа.

Abstract

Свиньи становятся все более популярными в крупных животных исследования трансляционной нейронауки в качестве экономически и этически возможной замены для приматов. Большой размер мозга свиньи позволяет использовать обычные томографы клинического мозга и прямое использование и тестирование нейрохирургических процедур и оборудования из человеческой клиники. Далее макроскопическое и гистологическое исследование, однако, требует посмертного воздействия на свиной центральную нервной системе (ЦНС) и последующего удаление головного мозга. Это не простая задача, как свиньи ЦНС инкапсулируется толстым, костистым черепом и позвоночником. Цель данной статьи и обучающего видео, чтобы описать, как выявить и удалить посмертный мозг свиньи и гипофиз в интактном состоянии, пригодный для последующего макроскопического и гистологического анализа.

Introduction

Трансляционные исследования неврологии у свинех становятся все более популярными в течение последних двух десятилетий. Большой размер мозга свиньи позволяет использовать обычные томографы клинического мозга и прямого использование и тестирования нейрохирургических процедур и оборудования из человеческой клиники 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. В течение последних 20 лет, свиней, особенно минисвиней (например, Гёттинген minipig), были использованы для изучения neuromodulatory методов лечения, таких как трансплантации стволовых клеток; вирусный вектор трансфекции; и глубокая стимуляция мозга направлены на болезнь Паркинсона, ожирение, депрессии и болезни Альцгеймера 2, 6,= "Xref"> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Это было с последующим развитием стереотаксической и хирургических подходов для манипулирования minipig ЦНС 3, 18, 19, 20, 21. В возбужденные изменения ЦНС были оценены в живых животных с использованием визуализации мозга (ПЭТ 10, 13, 22, 24 и MR 23), цистометрию 11, 12, 25, анализ походки17, неврологическая оценка 9, 17 и вскрытие на основе гистологии и стереологического анализа 14, 15, 17, 26, 27, 31. Однако посмертный анализ требует экспозиции и удаления головного мозга свиньи, которая не является легкой задачей, в виде густым, костистый черепа и волокнистый дюраль, покрывающий окружают головной мозг свиньи.

Цель данной статьи и обучающего видео, чтобы описать, как посмертная свинью мозг и гипофиз, могут быть выявлены и удалены в интактном состоянии в 15-20 мин с использованием безмоторных хирургическими инструментов. Обучающее видео и фотографические иллюстрации показывают мужские минисвиней (возраст: 6 месяцев, вес тела: 20-25 кг), используемые для анатомического исследования на minipig гипофиза.

Protocol

анестезии животных и euthanesia проводили в соответствии с «Принципами ухода за лабораторными животными» (NIH публикации № 86-23, пересмотренные 1985) и одобрен Советом Датских животных исследовательской этики. 1. инструменты Собирают инструменты , представленные в видео , ?…

Representative Results

Чтобы предотвратить материал ткани от высыхания, рекомендуются хранить удаленный мозг и гипофиз в банке, наполненный фиксатором или изотоническим солевой раствор сразу после макроскопического анализ был выполнен. Материал, ткань может быть сохранен в фиксаторе в те…

Discussion

Большинство экспериментальных исследований неврологии проводятся в небольших видов животных, таких как мыши и крысы, где доступ к ЦНС облегчается с помощью тонкой skull- и дуральной толщины. Однако в более крупных экспериментальных животных , таких как свиньи 1, <sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы с благодарностью искусной помощи миссис Трин W Миккелсен, г-ж Lise М. Место и сотрудники в Påskehøjgaard. Датский Совет по медицинским исследованиям, то Lundbeck фонд и Фонд Novo Nordisk при финансовой поддержке исследования.

Materials

Heavy Scalpel Handle #4 FST (Fine Science Tools) 10008-13 Good for skin incision and soft tissue removal
Non-Sterile Scalpel Blades #23 FST  10023-00
Scalpel Handle #7 FST  10007-12 Optimal for dural incision and precision work
Non-Sterile Scalpel Blades #11 FST  10011-00
Surgical Forceps FST  11024-18 The tip of the surgical forceps ensure a firm grip 
Kerrison Bone Punch Aesculap Neurosurgery FF713R Must be robust, bite size 3-5 mm
Bone Rongeur Aesculap Neurosurgery MD615 Must be robust, bite size 15 x 5 mm
Bone Rongeur Aesculap Neurosurgery FO551R Must be robust, bite size 25 x 15 mm 
Bone Chisel Lawton 67-0335 The size of the chisel head should not exceed 20 mm
Mallet (Hammer) Millarco 5624108 Weigth 300 g, length 30 cm, head hit area size 2 x 2 cm
Micro-Scissor FST  14002-14  
Dissector Aesculap Neurosurgery OL165R
 Göttingen minipigs  Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, Denmark
Euthanimal pentobarbital
Ketamine Pfizer
Midazolam  Hameln Pharmaceuticals

References

  1. Lind, M. N., Moustgaard, A., Jelsing, J., Vajta, G., Cumming, P., Hansen, A. K. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neurosci Biobehav Rev. 31, 728-751 (2007).
  2. Bjarkam, C. R., et al. Neuromodulation in a minipig model of Parkinson disease. British J Neurosurg. 22 (Suppl. 1), S9-S12 (2008).
  3. Bjarkam, C. R., Cancian, G., Glud, A. N., Ettrup, K. S., Østergaard, L., Sørensen, J. C. MRI-guided stereotaxic targeting in pigs based on a stereotaxic localizer box fitted with an isocentric frame and use of SurgiPlan computer-planning software. J Neurosci Methods. 183 (2), 119-126 (2009).
  4. Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
  5. Bjarkam, C. R., et al. Safety and function of a new clinical intracerebral microinjection instrument for stem cells and therapeutics examined in the Göttingen minipig. Stereotact Funct Neurosurg. 88 (1), 56-63 (2010).
  6. Fjord-Larsen, L., et al. Long-term delivery of nerve growth factor by encapsulated cell biodelivery in the minipig basal forebrain. Mol Therapy. 18 (12), 2164-2172 (2010).
  7. Sørensen, J. C., et al. Development of neuromodulation treatments in a large animal model – Do neurosurgeons dream of electric pigs?. Prog Brain Res. 194, 97-103 (2011).
  8. Dolezalova, D., et al. Pig models of neurodegenerative disorders: utilization in cell replacement-based preclinical safety and efficacy studies. J Comp Neurol. 522 (12), 2784-2801 (2014).
  9. Mikkelsen, M., Moller, A., Jensen, L. H., Pedersen, A., Harajehi, J. B., Pakkenberg, H. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
  10. Danielsen, E. H., et al. The DaNEX study of embryonic mesencephalic, dopaminergic tissue grafted to a minipig model of Parkinson’s disease: Preliminary findings of effect of MPTP poisoning on striatal dopaminergic markers. Cell Transplant. 9 (2), 247-259 (2000).
  11. Dalmose, A., Bjarkam, C. R., Sørensen, J. C., Jørgensen, T. M., Djurhuus, J. C. Effects of high frequency deep brain stimulation on urine storage and voiding function in conscious minipigs. Neurourol Urodyn. 23 (3), 265-272 (2004).
  12. Dalmose, A., Bjarkam, C. R., Djurhuus, J. C. Stereotactic electrical stimulation of the pontine micturition center in the pig. Br J Urol. 95, 886-889 (2005).
  13. Andersen, F., Watanabe, H., Bjarkam, C. R., Danielsen, E. H., Cumming, P. Pig brain stereotaxic standard space: Mapping of cerebral blood flow normative values and effect of MPTP-lesioning. Brain Res Bull. 66 (1), 17-29 (2005).
  14. Glud, A. N., et al. Direct gene transfer in the minipig CNS using stereotaxic lentiviral microinjections. Acta Neurobiol Exp. 70 (3), 1-8 (2010).
  15. Glud, A. N., et al. Direct MRI-guided stereotaxic viral mediated gene transfer of alpha-synuclein in the minipig CNS. Acta Neurobiol Exp. 71 (4), 508-518 (2011).
  16. Ettrup, K. S., Sørensen, J. C., Rodell, A., Alstrup, A. K. O., Bjarkam, C. R. Hypothalamic deep brain stimulation influences autonomic and limbic circuitry involved in the regulation of aggression and cardiocerebrovascular control in the minipig. Stereotact Funct Neurosurg. 90 (5), 281-291 (2012).
  17. Nielsen, M. S., et al. Continuous MPTP intoxication in the minipig results in chronic parkinsonian deficits. Acta Neurobiol Exp. 76, 198-210 (2016).
  18. Bjarkam, C. R., et al. A MRI-compatible stereotaxic localizer box enables high-precision stereotaxic procedures in pigs. J Neurosci Methods. 139 (2), 293-298 (2004).
  19. Bjarkam, C. R., Jorgensen, R. L., Jensen, K. N., Sunde, N. A. A., Sørensen, J. C. H. Deep brain stimulation electrode anchoring using BioGlue®, a protective electrode covering, and a titanium microplate. J Neurosci Methods. 168, 151-155 (2008).
  20. Ettrup, K. S., et al. Basic Surgical Techniques in the Minipig: Intubation, Transurethral Bladder Catheterization, Femoral Vessel Catheterization, and Transcardial Perfusion. J Vis Exp. (52), e2652 (2011).
  21. Ettrup, K. S., Tornøe, J., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. A surgical device for minimally invasive implantation of experimental deep brain stimulation leads in large research animals. J Neurosci Methods. 200 (1), 41-46 (2011).
  22. Danielsen, E. H., et al. Positron emission tomography of living brain in minipigs and domestic pigs. Scand J Lab Anim Sci Suppl. 25 (1), 127-135 (1998).
  23. Røhl, L., et al. Time evolution of cerebral perfusion and ADC measured by MRI in a porcine stroke model. J Magn Reson Imaging. 15 (2), 123-129 (2002).
  24. Cumming, P., Gillings, N. M., Jensen, S. B., Bjarkam, C. R., Gjedde, A. Kinetics of the uptake and distribution of the dopamine D2/3 agonist (R)-N-[1-11C]n-propylnorapomorphine in brain of healthy and MPTP-poisoned Gottingen miniature pigs. Nucl Med Biol. 30 (5), 547-553 (2003).
  25. Jensen, K. N., Deding, D., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. Long-term implantation of deep brain stimulation electrodes in the pontine micturition centre of the minipig. Acta Neurochir. 151 (7), 785-794 (2009).
  26. Rosendal, F., et al. Does chronic low dose treatment with ciclosporin influence the brain? A histopathological study in pigs. Transplantation Proc. 37 (8), 3305-3308 (2005).
  27. Nielsen, M. S., Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R. The substantia nigra pars compacta of the minipig: An anatomical and stereological study. Brain Struct Funct. (4-5), 481-488 (2009).
  28. Sørensen, J. C., Bjarkam, C. R., Simonsen, C. Z., Danielsen, E., Geneser, F. A. Oriented sectioning of irregular tissue blocks in relation to computerized scanning modalities. Results from the domestic pig brain. J Neurosci Methods. 104, 93-98 (2000).
  29. Bjarkam, C. R., Pedersen, M., Sørensen, J. C. New strategies for embedding, orientation and sectioning of small brain specimens enable direct correlation to MR-images, brain atlases, or use of unbiased stereology. J Neurosci Methods. 108, 153-159 (2001).
  30. Bjarkam, C. R., Sørensen, J. C., Geneser, F. A. Distribution and morphology of serotonin-immunoreactive axons in the hippocampal region of the New Zealand white rabbit. I. Area dentata and hippocampus proper. Hippocampus. 13 (1), 21-37 (2003).
  31. Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C., Palomero-Gallagher, N. The telencephalon of the minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy. Brain Struct Funct. , (2016).
  32. Boltze, J., Nitzsche, B., Geiger, K. D., Schoon, H. A. Histopathological investigation of different MCAO modalities and impact of autologous bone marrow mononuclear cell administration in an ovine stroke model. Transl Stroke Res. 2, 279-293 (2011).
  33. Jortner, B. S. The return of the dark neuron. A histological artifact complicating contemporary neurotoxicologic evaluation. Neurotoxicology. 27, 628-634 (2006).

Play Video

Cite This Article
Bjarkam, C. R., Orlowski, D., Tvilling, L., Bech, J., Glud, A. N., Sørensen, J. H. Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal. J. Vis. Exp. (122), e55511, doi:10.3791/55511 (2017).

View Video