איתור של הפנמת קולטן מצמיד חלבון G-מופעל ליגנד ידי מיקרוסקופי Confocal
Summary
פרוטוקול זה מתאר זיהוי מיקרוסקופיה confocal של G הקולטן חלבון בשילוב (GPCR) ההפנמה בתאי יונקים. הוא כולל את התרבות התא הבסיסי, transfection, ואת הליך מיקרוסקופיה confocal מספק שיטה יעילה ובקלות לפירוש לזהות את לוקליזציה subcellular והפנמה של GPCR פיוז'ן-הביעו.
Abstract
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.
Introduction
תאים בעלי מכונות סחר משא להובלת תאי חומרים כגון הליגנדים, מיקרואורגניזמים, מזינים, וחלבונים-אל transmembrane התא לקבלת מידע, אנרגיה, ולמטרות אחרות 1, 2. זה קריטי עבור הומאוסטזיס הסלולר, רקמות פונקציה, והישרדות תא כללית. הביטוי מבוסס תאים של חלבונים היתוך פלורסנט הינה דרך ללמוד את לוקליזציה והפנמה של קולטנים transmembrane, כגון חלבון בשילוב קולטנים G (GPCR), ב מסלולי איתות 3.
הביטוי של חלבוני היתוך מתויגים עם החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מ ויקטוריה Aequorea המדוזה, בשילוב עם טכניקות גילוי קרינה ישירה, צבר הסכמה רחבה לגבי מיקוד חלבון מחקר 4, 5, 6. detecti GFP המבוססיש על היתרון של מתן אפשרות הדמיה בזמן אמת של תאים חיים, תוך הימנעות חפצים קיבוע 7. סדרת וקטורי שיבוט תכליתיים נבנתה כדי להקל על הביטוי בשילובי חלבון ה- GFP בתאים שונים 8, 9. וקטור pEGFP-N1 הוא וקטור הפלסמיד בשימוש נרחב ממוסחר קידוד חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP), אשר עבר אופטימיזציה מן GFP מהסוג פרא על קרינה בהירה ביטוי גבוה בתאי יונקים. כדי לבחון את אות הניאון של EGFP לידי ביטוי בתאי יונקים, מיקרוסקופ פלואורסצנטי צריך להתנהל עם עירור ב 488 ננומטר ואת פליטת ב 507 ננומטר, רצוי עם מיקרוסקופיה confocal.
ניטור לוקליזציה subcellular והפנמה בתיווך ליגנד של קולטנים היא טכניקה נפוצה לחקור את האות התמרה והתפקוד של GPCRs 10 </sעד>, 11. ברוב המקרים, הפנמה מובילה הקהיה של GPCRs (ההנחתה של תגובת הגירוי למרות הנוכחות של אגוניסטים) 12, 13. הקולטנים הפנימו ניתן לשלב לתוך הליזוזום והשפילו, או שהם יכולים להיות ממוחזרים חזרה אל פני התא, בהתאם לאופי של קולטנים ואת שורות תאים המשמשים בניסויים.
הקולטנים להורמון משחרר גונדוטרופין (GnRHRs) שייכים למשפחת GPCR ויש לי מבנה החלבון GPCR טיפוסית, עם מסוף אמינו-תאי, מסוף -COOH תאיים, ושבעה transmembrane (TM) תחומים 14. Transfection של Sj פלסמיד רקומביננטי GnRHR-EGFP (עם הגן GnRHR מן japonica Sepiella) ואת זיהוי מיקרוסקופיה confocal של GnRHR SJ-tagged EGFP (שבאה לידי ביטוי HEK293 תאים) נמסר לשנים הקודמותערמומי, ואת הקרינה GFP הוקמה ככתבת עבור מבחני לוקליזציה חלבון טראנסממברנלי 15. עכשיו, הפנמת Sj GnRHR, מופעל על ידי הורמון גונדוטרופין-שחרור japonica ס (Sj GnRH), הודגמה נימוסים הזמן- ו תלוי מינון על ידי מיקרוסקופ confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה יעילה ובקלות לפירוש לזהות את הלוקליזציה והפנמה התת-תאי של חלבון היתוך GPCR לידי ביטוי HEK293 תאים. הטכניקה ניתן להתאים בקלות עבור גנים רבים ושונים סוגי תאים, כגון עבור לוקליזציה הסלולר והפנמה של הקולטן corazonin מן Bombyx מורי בתאים HEK293 ו BmN <sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors of this paper would like to thank Prof. Jiayan Xie for technical assistance and equipment usage. This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41406137).
Materials
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1X) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. 생화학. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
