Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा लिगेंड सक्रिय जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर internalization की जांच
Summary
यह प्रोटोकॉल स्तनधारी कोशिकाओं में जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर (GPCR) internalization की कोंफोकल माइक्रोस्कोपी का पता लगाने का वर्णन है। यह बुनियादी सेल संस्कृति, अभिकर्मक, और कोंफोकल माइक्रोस्कोपी प्रक्रिया भी शामिल है और subcellular स्थानीयकरण और संलयन-व्यक्त GPCR के internalization पता लगाने के लिए एक कुशल और आसानी से व्याख्या तरीका प्रदान करता है।
Abstract
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.
Introduction
कोशिकाओं के परिवहन के लिए माल की तस्करी मशीनरी के अधिकारी बाह्य सामग्री-जैसे लाइगैंडों, सूक्ष्मजीवों, पोषक तत्वों, और transmembrane प्रोटीन-में जानकारी, ऊर्जा, और अन्य प्रयोजनों के 1, 2 के लिए सेल। यह सेलुलर homeostasis, ऊतक समारोह, और कुल मिलाकर सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है। फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन की कोशिका आधारित अभिव्यक्ति रास्ते 3 संकेत में स्थानीयकरण और इस तरह जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCR) के रूप में transmembrane रिसेप्टर्स,, के internalization का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है।
जेलीफ़िश Aequorea विक्टोरिया से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ टैग संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति, प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति पता लगाने की तकनीक के साथ संयुक्त, में व्यापक स्वीकृति प्राप्त की है प्रोटीन को लक्षित अनुसंधान 4, 5, 6। GFP आधारित detectiपर कोशिकाओं रहते हुए निर्धारण कलाकृतियों 7 से बचने के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुमति देता का लाभ दिया है। बहुमुखी प्रतिरूपण वेक्टर्स की एक श्रृंखला, 9 विभिन्न कोशिकाओं 8 में GFP के लिए प्रोटीन fusions की अभिव्यक्ति की सुविधा के लिए निर्माण किया गया है। pEGFP-N1 वेक्टर एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और वाणिज्यीकरण प्लाज्मिड एक बेहतर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) है, जो उज्जवल प्रतिदीप्ति और स्तनधारी कोशिकाओं में उच्च अभिव्यक्ति के लिए जंगली प्रकार GFP से अनुकूलित किया गया है एन्कोडिंग वेक्टर है। EGFP के फ्लोरोसेंट संकेत स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त निरीक्षण करने के लिए, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 488 एनएम पर उत्तेजना और 507 एनएम पर उत्सर्जन, अधिमानतः कोंफोकल माइक्रोस्कोपी के साथ साथ आयोजित किया जाना चाहिए।
Subcellular स्थानीयकरण और रिसेप्टर्स की ligand की मध्यस्थता internalization निगरानी एक आम तकनीक संकेत पारगमन और GPCRs 10 के समारोह की जांच के लिए है </s> 11 अप,। ज्यादातर मामलों में, internalization GPCRs के विसुग्राहीकरण (एगोनिस्ट की उपस्थिति के बावजूद प्रोत्साहन प्रतिक्रिया के क्षीणन) 12, 13 की ओर जाता है। भाँति रिसेप्टर्स लाइसोसोम में शामिल किया जा सकता है और अपमानित, या वे वापस कोशिका की सतह को रिसेप्टर्स और सेल प्रयोगों में इस्तेमाल किया लाइनों की प्रकृति के आधार पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता।
गोनॉडोट्रॉफिन- रिलीजिंग हार्मोन रिसेप्टर्स (GnRHRs) GPCR परिवार के हैं और एक बाह्य अमीनो टर्मिनल, एक intracellular -COOH टर्मिनल के साथ, एक ठेठ GPCR प्रोटीन संरचना है, और सात transmembrane (टीएम) डोमेन 14। पुनः संयोजक प्लाज्मिड Sj GnRHR-EGFP के अभिकर्मक (Sepiella जापोनिका से GnRHR जीन के साथ) और EGFP-टैग Sj GnRHR (HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त) की कोंफोकल माइक्रोस्कोपी का पता लगाने Previou सूचना मिली थीधूर्त, और GFP प्रतिदीप्ति transmembrane प्रोटीन स्थानीयकरण assays 15 के लिए एक पत्रकार के रूप में स्थापित किया गया था। अब, Sj GnRHR के internalization, द्वारा एस जापोनिका गोनॉडोट्रॉफिन- रिलीजिंग हार्मोन (Sj GnRH) सक्रिय, कोंफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा समय- और खुराक पर निर्भर शिष्टाचार में प्रदर्शित किया गया।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल subcellular स्थानीयकरण और HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त GPCR संलयन प्रोटीन के internalization पता लगाने के लिए एक कुशल और आसानी से व्याख्या तरीका प्रदान करता है। तकनीक आसानी से सेलुलर स्थानीयकरण और HEK293 औ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors of this paper would like to thank Prof. Jiayan Xie for technical assistance and equipment usage. This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41406137).
Materials
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1X) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. 생화학. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
