CAPRRESI：通过质粒恢复和限制酶位点插入的嵌合体装配
Summary
在这里，我们通过质粒恢复和限制性酶切位点插入（CAPRRESI）提供嵌合体装配，这是基于将限制酶位点插入同义词DNA序列和功能质粒恢复的方案。该协议是一种快速和低成本的融合蛋白质编码基因的方法。
Abstract
在这里，我们通过质粒恢复和限制性酶切位点插入（CAPRRESI）提供嵌合体装配。 CAPRRESI受益于原始质粒回收方法的许多优点，并引入限制酶消化以缓解DNA连接反应（嵌合体装配所需）。对于该协议，用户将野生型基因克隆到同一质粒（pUC18或pUC19）中。 在嵌套嵌合体的氨基酸序列区域的计算机选择之后，用户获得编码它们的所有同义词DNA序列。 Ad hoc脚本使用户能够确定所有同义词DNA序列。在此步骤之后，另一个Perl脚本在所有同义词DNA序列上搜索限制酶位点。该计算机分析也使用在pUC18 / 19质粒上发现的氨苄青霉素抗性基因（ ampR ）进行。用户在同义词区域内设计寡核苷酸，通过PCR破坏野生型和ampR基因。在obt之后调整和纯化互补DNA片段，进行限制酶消化。通过连接适当的互补DNA片段来实现嵌合体装配。为CAPRRESI选择了pUC18 / 19载体，因为它们具有技术优势，如小尺寸（2,686碱基对），高拷贝数，有利的测序反应特征和商业可用性。用于嵌合体装配的限制酶的使用消除了产生平端产物的DNA聚合酶的需要。 CAPRRESI是一种快速且低成本的融合蛋白质编码基因的方法。
Introduction
嵌合基因组装已被广泛用于分子生物学以阐明蛋白质功能和/或用于生物技术目的。存在融合基因的不同方法，如重叠PCR产物扩增1 ，质粒回收2 ，同源重组3 ，CRISPR-Cas9系统4 ，定位重组5和吉布森组装6 。这些都提供不同的技术优势;例如，重叠PCR设计的灵活性，质粒恢复期间的体内选择构建体 ，或CRISPR-Cas9和Gibson系统的高效率。另一方面，在执行这些方法时可能会出现一些困难;例如，前两种方法依赖于平头DNA片段，并且这些类型的产品的连接在技术上可能与stic结扎结扎。位点定向重组可以在原始样品上留下痕迹的额外的DNA序列（疤痕），如CrelxP系统5 。除了目标部位之外，CRISPR-Cas9有时可以修改其他基因组区域。
在这里，我们通过质粒回收和限制性内切酶位点插入（CAPRRESI）介绍嵌合体装配，这是一种融合蛋白质编码基因的方案，将基因质粒恢复方法（PRM）与限制酶位点插入同义词DNA序列，增强连接效率。为了确保氨基酸序列的完整性，将限制酶位点插入同义词DNA序列片段。 CAPPRESI的优点之一是可以使用普通的实验室试剂/工具（ 如酶，感受态细胞，溶液和热循环仪）进行，并且可以快速测定结果（使用适当的酶时）。依靠限制从同义词DNA序列出现的酶位点可以限制目标蛋白内部精确融合点的选择。在这种情况下，应使用重叠的寡核苷酸融合靶基因，并将限制酶位点插入到载体的抗性基因上。
CAPRRESI由七个简单步骤组成（ 图1 ）：1）选择克隆载体pUC18或pUC19 6 ; 2）待融合的野生型序列的计算机分析; 3）嵌合体装配和质粒破坏的断裂区域的选择; 4） 计算机生成含有限制酶位点的同义词DNA序列; 5）将野生型基因独立克隆到所选择的质粒中; 6）通过PCR进行质粒破坏，然后进行限制酶消化;和7）使用DNA连接和细菌转化的质粒回收。应该验证这种技术产生的嵌合基因测序。
pUC18 / 19载体提供克隆和嵌合体装配的技术优势，如小尺寸（ 即 2,686碱基对），高拷贝数，有利的测序反应特征和商业可用性7 。在这里，使用大肠杆菌宿主来组装和处理嵌合体，因为细菌培养物便宜且生长快。鉴于此，将需要随后将融合片段克隆到最终靶质粒中（ 例如，在哺乳动物细胞中的细菌或pCMV中的pRK415的表达载体）。
测试CAPRRESI融合两个主要的σ因子基因： 大肠杆菌D和根瘤菌（Rhizobium etlisigA） 。原始sigma因子是负责转录起始的RNA聚合酶亚基，它们由四个结构域组成（ 即 σ1，σ2，σ3和σ4） 8 。氨基酸序列长度由rpoD和sigA编码的蛋白质的h分别为613和685。 RpoD和SigA共享48％的身份（98％的覆盖率）。这些主要的σ因子在区域σ2和σ3之间分成两个互补的片段。根据该设计组装两个嵌合基因：嵌合体01（RpoDσ1-σ2+SigAσ3-σ4）和嵌合体02（SigAσ1-σ2+RpoDσ3-σ4）。通过测序验证DNA融合产物。
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESI被设计为PRM 2的替代品。原来的PRM是一种强大的技术;它允许沿所选基因的任何部分融合DNA序列。对于PRM，野生型基因应该被克隆到相同的质粒中。之后，在质粒内发现野生型和抗生素抗性基因内设计寡核苷酸。通过使用平端，高保真DNA聚合酶和先前设计的寡核苷酸的PCR实现质粒破坏。互补PCR产物的连接组装嵌合基因并恢复抗生素抗性盒，导致功能质粒恢复。 PRM使得能够在…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了墨西哥国家科学委员会，墨西哥国家科学委员会（ACACYT），墨西哥国家科学院（154833）和墨西哥国立自治大学的支持。作者希望感谢VíctorGonzález，Rosa I.Santamaría，Patricia Bustos和SoledadJuárez的行政和技术咨询。
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
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