2 가지 plant organellar DNA 농축 방법의 비교 및 최적화가 제시됩니다 : 전통적인 차동 원심 분리 및 메틸화 상태에 기초한 총 gDNA 분획. 우리는 결과로 나오는 DNA 양과 품질을 평가하고, 짧은 읽기 차세대 시퀀싱에서의 성능을 시연하며, 장시간 읽기 단일 분자 시퀀싱에서의 사용 가능성에 대해 논의합니다.
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방법 논문
차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
식물 세포 소기관 게놈은 복잡한 구조 및 / 또는 서브 게놈 조각을 형성하기 위해 페어링 또는 재조합을 거칠 수있는 크고 반복적 인 요소를 포함합니다. Organellar 게놈은 또한 주어진 세포 또는 조직 유형 (heteroplasmy) 내의 혼합물에 존재하며, 아형의 다량은 발육 기간 동안 또는 스트레스하에있을 때 (부분 화학량 론적 이동) 변화 할 수있다. 세포 기관 게놈 구조와 기능에 대한 더 깊은 이해를 위해서는 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술이 필요합니다. 전통적인 sequencing 연구는 organellar DNA를 얻기 위해 몇 가지 방법을 사용합니다 : (1) 대량의 시작 조직이 사용되면 균질화되고 차등 원심 분리 및 / 또는 기울기 정화가 이루어집니다. (종자, 재료 또는 공간이 한정되어있는 경우, 즉) (2) 조직의 작은 양이 사용된다면, 동일한 프로세스는 (1) 충분한 DNA를 얻기 위해 전체 게놈 증폭 다음과 같이 수행된다. (3) 생물 정보학 분석은 seq전체 게놈 DNA를 분석하고 세포 기관 판독을 분석합니다. 이러한 모든 방법에는 고유 한 문제점과 단점이 있습니다. (1)에서 이와 같이 많은 양의 시작 조직을 얻는 것이 어려울 수 있습니다. (2)에서, 전체 게놈 증폭은 시퀀싱 바이어스를 도입 할 수있다; (3)에서 핵과 세포 내 게놈 간의 상동 성은 집합과 분석을 방해 할 수있다. 거대한 핵 게놈을 가진 식물에서, organellar DNA를 풍부하게하여 생물 정보학 분석을위한 서열화 비용 및 서열 복잡성을 줄이는 것이 유리하다. 여기에서 전통적인 차동 원심 분리 방법과 네 번째 방법 인 CpG- 메틸 풀다운 방식을 비교하여 총 게놈 DNA를 핵 및 세포 내 분획으로 분리합니다. 두 가지 방법 모두 미토콘드리아와 엽록체의 비율이 다르긴하지만 세포 내 소기관 서열에 대해 고도로 농축 된 DNA 인 NGS에 충분한 양의 DNA를 생산합니다. 우리는 밀 잎 조직을위한 이러한 방법의 최적화를 제시하고 주요 이점과 d샘플 입력, 프로토콜 용이성 및 다운 스트림 응용 프로그램의 맥락에서 각 접근법의 단점.
서론
게놈 시퀀싱은 중요한 식물 형질의 기본 유전 적 기초를 분석하는 강력한 도구입니다. 대부분의 게놈 시퀀싱 연구는 대부분의 유전자가 핵에 위치하므로 핵 게놈 내용에 초점을 맞 춥니 다. 그러나, (진핵 생물에서) 미토콘드리아와 색소체 포함 organellar 게놈 (식물, 전문화 된 형태로, 엽록체, 광합성에서 작동)는 생명체의 개발, 스트레스 반응 및 전반적인 체력 1에 필수적인 중요한 유전 정보를 기여한다. Organellar 게놈은 일반적으로 핵 게놈 시퀀싱을위한 총 DNA 추출에 포함되지만 DNA 추출 이전에 세포 소기관 수를 줄이는 방법도 사용됩니다 2 . 많은 연구에서 전체 gDNA 추출물의 sequencing 결과를 사용하여 organellar 게놈 3 , 4 , 5 ,xref "> 6 , 7. 그러나 연구 대상이 세포 소기관 게놈에 초점을 맞추고있을 때 많은 gDNA가 핵산 염기 서열에"손실 "되어 있기 때문에 전체 핵산을 사용하면 시퀀....
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프로토콜
1. 세포질 분리 및 DNA 추출을위한 식물 재료의 생성
- 밀 묘목의 표준 성장
- 구석 당 4 ~ 6 개 종자가있는 작고 정방형의 냄비에 질석에 식물 종자를 심습니다. 온실 또는 성장 챔버로 16 시간주기, 23 ℃ / 18ºC 밤으로 옮긴다.
- 매일 식물에 물을주십시오. 발아시 및 발아 후 7 일째에 ½ 티스푼의 과립 20-20-20 NPK 비료로 식물을 비옥하게하십시오.
- 밀 묘종의 대안 적 순환
- 1.1 단계를 따르되 냄비를 진한 성장 챔버, 23 ° C에서 16 시간 / 18 ° C 동안 8 시간 동안 둔다. 또는 온실에서 식물을 덮으십시오 ( 예 : 저장 용기로, 그러나 적절한 환기가 유지되어야 함).
- 성장 및 조직 수집
- 12 ~ 14 일 동안 식물을 재배하십시오. 대부분의 밀 유전자형s, 75-100 묘목은 약 10-12 g의 조직을 생성하는데, 이는 차동 원심 분리 방법 (섹션 2)을 사용하는 두 개의 세포 기관 추출에 충분하다. 핵 DNA에서 세포 소기관을 분획하기 위해 DNA CpG- 메틸화 기반 풀다운 접근법을 이용하는 ....
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결과
이 원고에 제시된 프로토콜은 식물 조직에서 세포 기관 DNA를 풍부하게하는 두 가지 방법을 설명합니다. 여기에 제시된 조건은 밀의 조직 최적화를 반영합니다. 프로토콜의 주요 단계, 필요한 조직 입력 및 DNA 출력의 비교는 그림 1에 설명되어 있습니다. 우리가 테스트 한 DC 프로토콜의 단계는 이전에 설명한 것과 비슷한 조건을 따른다 ( 그림 1A ). 수확 된 조직은 신선하게 처리해야하며 차별화 된 원심 분리 및 / 또는 그라디언트를 적용하여 손상되지 않은 세포 기관을 분리해야합니다. 소기관이 용해되기 전에 핵 DNA가 제거되고 마지막으로 DNA가 추출되어 하류 적용에 사용됩니다. 대조적으로, MF 프로토콜에서, 식물 조직은 사용 전에 수확되고 저장 될 수 있으며, 손상되지 않은 세포 소기관은 필요하지 않습니다. 그 대신, 핵 및 세포 기관 DNA는 전체 gDN.......
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토론
지금까지 대부분의 organellar sequencing 연구는 특정 DC를 풍부하게하는 전통적인 DC 방법에 초점을두고 있습니다. 모스 ( 40)를 포함하여 다양한 식물로부터 세포 소기관을 분리하는 방법이 설명되었다. 밀 15 및 귀리 11 과 같은 단핵구; 아라비돕시스 11 , 해바라기 17 , 유채 14 등의 족자입니다. 대부분의 프로토콜은 잎 조직 13 , 14 , 15 , 16 , 17<.......
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공개 사항
저자는 경쟁적 이익이 없다고 선언합니다.
이 간행물의 상호 또는 상업 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기위한 목적 일 뿐이며 미 농무부 (US Department of Agriculture)의 추천이나 보증을 의미하지는 않습니다. USDA는 기회 균등 제공자이자 고용주입니다.
감사의 글
우리는 미국 농무부 농업 연구청과 국립 과학 재단 (IOS 1025881 및 IOS 1361554)으로부터 자금을 지원하고 싶습니다. 우리는 R. Caspers에게 온실 유지 관리 및 식물 관리에 감사드립니다. 우리는 Illumina 라이브러리 준비 및 시퀀싱이 수행 된 Minnesota Genomics Center 대학에도 감사드립니다. 저널 편집자와 4 명의 익명의 평론가가 우리 원고를 더욱 강화시킨 것에 대해 감사드립니다. 우리는 또한 OECD가 일본의 동료들과 협력 프로젝트를 위해 이러한 프로토콜을 통합하는 SK와의 협력에 감사한다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| 2-메르캅토에탄올(베타-메르캅토에탄올; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-프로판올(이소프로필 알코올/이소프로판올), 생물 시약 | Sigma Aldrich | I9516 | |
| 아가로스, Bio-Rad Cetified Megabase 아가로스 | Bio-Rad | 1613108 | |
| 분석 저울 | Mettler Toledo | AB54-S | |
| 저울 | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| 세라믹 분쇄 실린더, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| 50 mL 튜브 고정용 조직 균질화기와 호환되는 극저온 블록 | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| 에탄올, 앱솔루트 | Decon Laboratories | 2716 | |
| 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 0.5m 용액, pH 8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
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| 겔 염색 | GelRed 또는 Ethidium Bromide | ||
| 분쇄 유봉, 2mL 원추형 튜브 | |||
| Guanidine-HCl, 8M 용액 | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| 액체 질소 | |||
| 용해 효소 Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| 마그네슘 클로라이드 | G Bioscience | 24115 | |
| 자기 랙 | ThermoFisher | A13346 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브, LoBind 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, 표준 nuclease-free 1.5 mL | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, 냉장 | Sorvall | 범례 X1R | 또는 동급의 제품은 50 mL 튜브, Oak Ridge 튜브 및 1.5 mL 튜브용 로터로 최소 18,000 x g에 도달할 수 있어야 합니다 |
| 마이크로 원심분리기, 실온 | Eppendorf | 5424 | 또는 이와 동등한 제품은 1.5 mL 및 2 mL 마이크로 원심분리기 튜브용 로터를 사용하여 최소 18,000 x g에 도달할 수 있어야 합니다 |
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| 설탕 | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| 써모믹서 | |||
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| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
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| 튜브, 50mL 원추형 폴리프로필렌 | Corning | 352070 | |
| 튜브, 50mL 고속 폴리프로필렌 | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | 예: Nalgene Oakridge 튜브 또는 동등한 |
| 질석 | |||
| 물 목욕 | |||
| 물, 멸균 및 인증된 Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| 물, 멸균 milliQ |
참고문헌
- Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
- Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T.
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재인쇄 및 허가
