Le modèle WinCF - Un microcosme peu coûteux et abordable d'une menthe bronchée à mousqueton pour étudier la microbiologie des infections pulmonaires
Summary
Les voies respiratoires du mucus des patients atteints de fibrose kystique (CF) sont un environnement idéal pour que les agents pathogènes microbiens puissent prospérer. Le manuscrit décrit une nouvelle méthode pour étudier le microbiome des poumons des FC dans un environnement qui imite où ils causent des maladies et comment les altérations des conditions chimiques peuvent entraîner une dynamique microbienne.
Abstract
Beaucoup de maladies chroniques des voies respiratoires entraînent une bouchage de mucus des voies respiratoires. Les poumons d'un individu atteints de fibrose kystique sont un cas exemplaire où leurs bronchioles bouchées de mucus créent un habitat favorable pour la colonisation microbienne. Divers agents pathogènes se développent dans cet environnement en interaction entre eux et entraînent une grande partie des symptômes associés à la maladie des FC. Comme toute communauté microbienne, les conditions chimiques de leur habitat ont un impact significatif sur la structure et la dynamique de la communauté. Par exemple, différents microorganismes se développent dans différents niveaux d'oxygène ou d'autres concentrations de soluté. Ceci est également vrai dans le poumon des FC, où les concentrations d'oxygène sont censées conduire la physiologie et la structure de la communauté. Les méthodes décrites ici sont conçues pour imiter l'environnement pulmonaire et cultiver des agents pathogènes d'une manière plus similaire à celle d'où ils causent une maladie. La manipulation de l'environnement chimique de ces microbes est ensuite utilisée pour étudier comment le chemiDes infections pulmonaires régit son écologie microbienne. La méthode, appelée système WinCF, est basée sur des tubes artificiels à l'épi et des tubes capillaires étroits destinés à fournir un gradient d'oxygène similaire à celui qui existe dans les bronchioles bouchées de mucus. La manipulation des conditions chimiques, telles que le pH du média de la pression des crachats ou des antibiotiques, permet de visualiser les différences microbiologiques dans ces échantillons en utilisant des indicateurs colorés, en surveillant la production de gaz ou de biofilms, ou en extrayant et séquençant le contenu en acide nucléique de chaque échantillon.
Introduction
La méthode décrite dans ce manuscrit s'appelle le système WinCF 1 . L'objectif global de WinCF est de fournir une configuration expérimentale capable de simuler l'environnement d'une bronchole pulmonaire remplie de mucus. Cela permettra à un système traçable d'étudier les agents pathogènes microbiens des maladies pulmonaires avec un phénotype de l'hypersécrétion du mucus incluant la fibrose kystique (FC), la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), l'asthme et d'autres. La procédure a été conçue spécifiquement pour l'étude de la FC, qui se caractérise par des mutations qui font que les sécrétions pulmonaires deviennent épaisses et difficiles à nettoyer, finissant par remplir les bronchioles et d'autres petits passages avec le mucus 2 . De tels blocages dans les poumons inhibent l'échange de gaz parce que l'air inhalé n'est plus capable d'atteindre de nombreux alvéoles et fournit également un habitat pour la colonisation bactérienne 3 , 4 . L'incapacité à prévenir la croissance microbiennemucus pulmonaire excessive conduit finalement au développement d'infections chroniques complexes des voies respiratoires. Ces communautés contiennent une variété d'organismes, y compris les virus, les champignons et les bactéries comme Pseudomonas aeruginosa, toutes les composantes interagissent entre eux 5, 6, 7, 8. On croit que l'activité du microbiome pulmonaire des FC à participer à des poussées de symptômes appelés exacerbations pulmonaires 1, 9, 10, 11. WinCF permet d'étudier le comportement de la communauté microbienne autour de ces exacerbations et est maintenant étendu à agir en tant que système expérimental de base pour étudier l'écologie microbienne du poumon. Traditionnellement, les exacerbations ont été étudiés par l'analyse directe des échantillons prélevés dans les poumons. De nombreux facteurs de confusion rendent l'analyse directe de b microbienneehavior dans les poumons difficiles, avec le système WinCF, bon nombre de ces facteurs sont retirés et le comportement du microbiome pulmonaire peuvent être étudiés plus directement, ce qui permet une analyse plus fine de l'activité bactérienne dans un bronchioles branché mucus.
Le système WinCF fournit une méthode pour développer et analyser les bactéries d'une manière qui imite efficacement l'environnement pulmonaire. Les méthodes traditionnelles pour la culture des bactéries pulmonaires échantillons de culture souvent impliqués sur des plaques d'agar traditionnelles. Ces méthodes laissent les échantillons ouverts à l' oxygène atmosphérique, en négligeant de tenir compte du hypoxique et des conditions souvent anoxiques trouvées dans les bronchioles pulmonaires bouchés avec du mucus 12, 13. Agar sur la culture dans des conditions aérobies est rien comme l'environnement du poumon CF et peut induire en erreur les cliniciens et les chercheurs concernant le comportement des agents pathogènes qu'ils essaient de traiter. De plus, les éléments nutritifs aux bactéries sur des plaques de géloseSont différents de ceux disponibles dans l'expectoration réelle, qui est comptabilisé dans WinCF en utilisant des mousses artificielles (ASM). Comme le montrent les cultures de Pseudomonas dans Sriramulu et al. 14 , ASM comprend un ensemble spécifique de composants qui imite les ressources disponibles pour les microbes de crachats et réplique également la consistance physique des expectorations. Étant donné qu'un poumon malade possède un microbiome spécifique, l'étude de ces microorganismes devrait également se faire dans les conditions spécifiques du poumon.
Le système WinCF permet une analyse rapide et une manipulation facile des conditions expérimentales pour observer des changements microbiens semblables à la façon dont ils se produiraient dans une bronchole pulmonaire réelle. Cette technique permet l'inoculation d'une myriade de types d'échantillons apparentés, y compris les expectorations, la salive, les autres sécrétions corporelles et les cultures bactériennes pures ou mélangées. La nature de l'installation expérimentale permet une interprétation visuelle immédiate dele comportement de la communauté microbienne et est conçu pour permettre l'application en aval facile d'une multitude de procédés microbiologiques et omiques. De telles études sont importantes parce que les changements de composition de la communauté bactérienne sur la base des conditions physico-chimiques de leur environnement. Avec WinCF les conditions chimiques des médias peuvent être manipulés pour analyser les effets sur l'activité bactérienne. Par exemple, peut être modifié l'acidité des médias avant l'inoculation d'un échantillon. Après incubation, l'activité bactérienne dans chacune de ces conditions peut être comparé directement et conclusions peuvent être tirées sur la façon dont les bactéries dans les échantillons de crachats se comportent en réponse à un pH variable. Ici, nous présentons les modalités d'application du système WinCF et des exemples de la façon dont la chimie des médias peut être manipulé pour étudier les effets sur le microbiome pulmonaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le maquillage microbiologique d'un poumon avec CF contient une grande variété d'organismes, mais les conditions dans le poumon ont vraisemblablement une influence importante sur les types de microbes qui peuvent survivre et prospérer 13 , 15 . Les mécanismes spécifiques par lesquels ces conditions changent et les effets exacts qu'elles ont sur le microbiome pulmonaire sont généralement peu clairs actuellement. Dans cette méthode expérimental…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier Vertex Pharmaceuticals et le Cystic Fibrosis Research Innovation Award pour le financement de R. Quinn et du NIH / NIAID pour le financement de la subvention 1 U01 AI124316-01, une approche de la biologie des systèmes pour le traitement des agents pathogènes résistant aux multiples médicaments. Nous tenons également à remercier le Département de l'ingénierie mécanique et aérospatiale du cours de conception senior de génie mécanique de premier cycle de l'UCSD pour faciliter la collaboration avec les aspects techniques de ce travail.
Materials
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
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