El modelo de WinCF - un microcosmos barato y tractable de un bronquio enchufado del moco para estudiar la microbiología de las infecciones pulmonares
Summary
El moco enchufado vías respiratorias de la fibrosis quística (FQ) son un ambiente ideal para los patógenos microbianos para prosperar. El manuscrito describe un nuevo método para el estudio de la microbioma CF pulmón en un entorno que imita donde causan enfermedad y cómo alteraciones de condiciones químicas pueden conducir dinámica microbianas.
Abstract
Muchas enfermedades crónicas de las vías respiratorias resultan en el taponamiento de moco de las vías respiratorias. Los pulmones de un individuo con fibrosis quística son un caso ejemplar en el que sus bronquiolos taponados con moco crean un hábitat favorable para la colonización microbiana. Varios patógenos prosperan en este entorno interactuando entre sí y conduciendo muchos de los síntomas asociados con la enfermedad de los FQ. Como cualquier comunidad microbiana, las condiciones químicas de su hábitat tienen un impacto significativo en la estructura y dinámica de la comunidad. Por ejemplo, diferentes microorganismos prosperan en diferentes niveles de oxígeno u otras concentraciones de soluto. Esto también es cierto en el pulmón de la FQ, donde se cree que las concentraciones de oxígeno impulsan la fisiología y la estructura de la comunidad. Los métodos descritos aquí están diseñados para imitar el entorno pulmonar y producir patógenos de una manera más similar a la de la que causan la enfermedad. La manipulación del entorno químico de estos microbios se utiliza entonces para estudiar cómo el chemistry de infecciones pulmonares gobierna su ecología microbiana. El método, llamado el sistema WinCF, se basa en medio esputo artificial y tubos capilares estrechos destinados a proporcionar un gradiente de oxígeno similar a la que existe en los bronquiolos moco enchufado. La manipulación de las condiciones químicas, tales como el pH del medio del esputo o antibióticos presión, permite la visualización de las diferencias microbiológicos en estas muestras usando indicadores de color, en busca de la producción de gas o biofilm, o de la extracción y secuenciación de los contenidos de ácido nucleico de cada muestra.
Introduction
El método descrito en este manuscrito se llama el sistema WinCF 1. El objetivo general de WinCF es proporcionar un montaje experimental capaz de simular el ambiente de un bronquiolo de pulmón lleno de moco. Esto permitirá un sistema tratable para estudiar los patógenos microbianos de las enfermedades pulmonares con un fenotipo hipersecreción mucosa incluyendo la fibrosis quística (FQ), la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma y otros. El procedimiento fue diseñado específicamente para el estudio de CF, que se caracteriza por mutaciones que causan las secreciones pulmonares a convertirse espeso y difícil de limpiar, con el tiempo de llenado bronquiolos y otros pasos de pequeñas con mucosidad 2. Tales bloqueos en el pulmón inhiben el intercambio de gas, porque el aire inhalado ya no es capaz de alcanzar muchas alvéolos y también proporcionar un hábitat para la colonización bacteriana 3, 4. La incapacidad para prevenir el crecimiento microbiano en elExcesivo moco pulmonar eventualmente conduce al desarrollo de complejas infecciones crónicas de las vías respiratorias. Estas comunidades contienen una variedad de organismos, incluyendo virus, hongos y bacterias como Pseudomonas aeruginosa , que interactúan entre sí 5 , 6 , 7 , 8 . Se cree que la actividad del microbioma pulmonar de la FQ está implicada en brotes de síntomas llamados exacerbaciones pulmonares 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF permite estudiar el comportamiento de la comunidad microbiana en torno a estas exacerbaciones y ahora se está expandiendo para actuar como un sistema experimental base para estudiar la ecología microbiana pulmonar. Tradicionalmente, las exacerbaciones se han estudiado a través del análisis directo de muestras tomadas del pulmón. Muchos factores de confusión hacen que el análisis directo de microbios bEl comportamiento en los pulmones desafiante, con el sistema WinCF, muchos de estos factores se eliminan y el comportamiento del microbioma pulmonar se puede estudiar más directamente, lo que permite un análisis más fino de la actividad bacteriana en un mucosidad taponada bronquiolos.
El sistema WinCF proporciona un método para crecer y analizar las bacterias de una manera que imita eficazmente el ambiente pulmonar. Los métodos tradicionales para el cultivo de bacterias pulmonares a menudo implicaban el cultivo de muestras en placas de agar tradicionales. Estos métodos dejan las muestras abiertas al oxígeno atmosférico, dejando de lado las condiciones hipóxicas ya menudo anóxicas encontradas en los bronquiolos pulmonares taponados con moco 12 , 13 . El cultivo en agar bajo condiciones aeróbicas no es nada como el ambiente del pulmón de la FQ y puede inducir a error a los clínicos e investigadores sobre el comportamiento de los patógenos que tratan de tratar. Además, los nutrientes disponibles para las bacterias en placas de agarSon disímiles a los disponibles en el esputo real, que se explica en WinCF utilizando medios de esputo artificiales (ASM). Como se muestra por los cultivos de Pseudomonas en Sriramulu et al. 14 , ASM incluye un conjunto específico de componentes que imita los recursos disponibles para los microbios de esputo y también reproduce la consistencia física del esputo. Debido a que un pulmón enfermo tiene un microbioma específico, el estudio de tales microorganismos debería tener lugar idealmente en las condiciones específicas del pulmón también.
El sistema WinCF permite un análisis rápido y una fácil manipulación de las condiciones experimentales para observar cambios microbianos similares a cómo ocurrirían en un bronquio pulmonar real. Esta técnica permite la inoculación de una miríada de tipos de muestras relacionadas incluyendo esputo, saliva, otras secreciones corporales y cultivos bacterianos puros o mixtos. La naturaleza de la configuración experimental permite la interpretación visual inmediata deel comportamiento de la comunidad microbiana y está diseñado para permitir una fácil aplicación aguas abajo de una multitud de procedimientos microbiológicos y ómicas. Tales estudios son importantes porque bacterianas cambios en la composición de la comunidad basados en las condiciones fisicoquímicas de su entorno. Con WinCF las condiciones químicas de los medios de comunicación pueden ser manipulados para analizar los efectos sobre la actividad bacteriana. Por ejemplo, la acidez de los medios de comunicación puede ser alterada antes de la inoculación con una muestra. Después de la incubación, la actividad bacteriana en cada una de estas condiciones puede ser comparado directamente, y se pueden sacar conclusiones acerca de cómo las bacterias en las muestras de esputo se comportan en respuesta a la variación del pH. A continuación, describimos los procedimientos de aplicación del sistema de WinCF y ejemplos de cómo la química de los medios puede ser manipulado para estudiar los efectos sobre el microbioma de pulmón.
Protocol
Representative Results
Discussion
La composición microbiológica de un pulmón con CF contiene una gran variedad de organismos, pero las condiciones dentro del pulmón probablemente tienen una influencia significativa sobre qué tipos de microbios pueden sobrevivir y prosperar [ 13 , 15] . Los mecanismos específicos a través de los cuales estas condiciones cambian y los efectos exactos que tienen en el microbioma pulmonar son generalmente poco claros en la actualidad. En este método experime…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Vertex Pharmaceuticals y al Premio a la Innovación en Investigación de la Fibrosis Quística por financiar a R. Quinn y al NIH / NIAID por la subvención 1 U01 AI124316-01, un enfoque de biología de sistemas para el tratamiento de patógenos resistentes a múltiples fármacos. También queremos agradecer al Departamento de Ingeniería Mecánica y Aeroespacial del curso de diseño superior de ingeniería mecánica de UCSD para facilitar la colaboración con los aspectos de ingeniería de este trabajo.
Materials
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
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