Techniques pour induire et Quantifier cellulaire sénescence
Summary
Cellulaire sénescence, l'état irréversible de l'arrêt du cycle cellulaire, peut être induite par diverses contraintes cellulaires. Ici, nous décrivons les protocoles pour induire la sénescence cellulaire et des méthodes pour évaluer les marqueurs de sénescence.
Abstract
En réponse au stress cellulaire ou les dommages, les cellules qui prolifèrent peuvent induire un programme spécifique qui déclenche un état d'arrêt du cycle cellulaire à long terme, appelé sénescence cellulaire. L' accumulation de cellules sénescentes se produit avec le vieillissement organismal et par mise en culture continue in vitro. Les cellules sénescentes influencent de nombreux processus biologiques, y compris le développement embryonnaire, la réparation et la régénération des tissus, la suppression des tumeurs et le vieillissement. Poinçons de cellules sénescentes comprennent, mais sans s'y limiter, l'augmentation de l'activité β-galactosidase associée sénescence (SA-β-gal); p16 INK4a, p53 et p21 niveaux; des niveaux plus élevés de dommages à l'ADN, y compris les γ-H2AX; la formation d'hétérochromatine associée à la sénescence Foci (SAHF); et l'acquisition d'une sécrétoire associée sénescence Phénotype (SASP), un phénomène caractérisé par la sécrétion d'un certain nombre de cytokines pro-inflammatoires et des molécules de signalisation. Ici, nous décrivons les protocoles pour les réplicative etADN sénescence dommages induits dans les cellules en culture. De plus, nous mettons en évidence des techniques pour surveiller le phénotype sénescent en utilisant plusieurs marqueurs associés à la sénescence, y compris SA-β-gal, γ-H2AX et la coloration SAHF, et de quantifier les niveaux de protéines et d'ARNm des régulateurs du cycle cellulaire et les facteurs SASP. Ces méthodes peuvent être appliquées à l'évaluation de la sénescence dans divers modèles et tissus.
Introduction
Il y a plus d' un demi – siècle, Hayflick et ses collègues ont décrit comment les cellules prolifèrent dans la culture non transformée, mais seulement pour une période de temps limitée 1. la culture à long terme des fibroblastes humains a provoqué les cellules pour arrêter la prolifération; cependant, ils étaient métaboliquement actifs, ce qui a été appelé sénescence cellulaire. Sénescence peut être bénéfique pour inhiber la tumorigenèse, mais il peut aussi être préjudiciable, car on pense contribuer à la perte de la capacité de régénération qui se produit avec le vieillissement 2, 3. Les cellules sénescentes ont été montré à accumuler dans les tissus humains comme 4 ans et ont été impliqués dans un certain nombre de processus biologiques, y compris le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, la réparation des tissus et l' inflammation liée à l' âge 2.
repiquage continue des cellules en culture induit la sénescence réplicative, qui a été liéeà télomère attrition et de l'instabilité génomique. Divers stress cellulaires, y compris les lésions de l' ADN et des oncogènes, peuvent également provoquer la sénescence 3. Sénescence causés par des facteurs autres que l' attrition des télomères est souvent appelé sénescence induite par le stress ou prématurée et dépend généralement de la voie INK4A / Rb p16 5. Bien que la prolifération, les cellules non transformées apparaissent généralement broche en forme, des cellules sénescentes peuvent être identifiés comme ayant certaines caractéristiques, comprenant un plat, une grande morphologie et augmentation de l' activité β-galactosidase associé à la sénescence (SA-β-gal) (figures 1 et 2). Les cellules sénescentes accumulent également ADN marqueurs de dégâts, y compris γ-H2AX (Figure 3) 6, et, éventuellement, des foyers d'hétérochromatine associée sénescence (SAHF) (Figure 4) 7. Les cellules sénescentes ont des niveaux plus élevés de régulateurs du cycle cellulaire, y compris les p 16 (p16 INK4A) et / ou p21 et p53 (Figure 5) 8, 9. De plus, des données récentes ont montré que les cellules sénescentes peuvent avoir des effets non autonomes en sécrétant un certain nombre de cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines appelé le phénotype sécrétoire associée sénescence (SASP) 10. Bien que ce phénomène de SASP peut varier d'un type de cellule du type de cellule, en général, il est démontré par une augmentation de l'interleukine-6 (IL-6), IL-8, les colonies de granulocytes-macrophages facteur de stimulation (GM-CSF), growth- réglementé oncogène α (GRO-α), et GRO-β, entre autres (Figure 6). La contrainte particulière ou des dommages qui induit sénescence peuvent également influencer le phénotype sécrétoire 11, 12, 13. SASP peut être détectée en mesurant les niveaux de protéines sécrétées à l'aide de tests ELISA ou des réseaux cytokine / protéines = "xref"> 10, 14. Bien que les mécanismes post-transcriptionnel peuvent réguler les taux de protéines 11, 15 SASP, 16, 17, des changements dans de nombreux cas peuvent également être détectés dans les niveaux d' ARNm. Ces changements sont généralement plus sensibles et plus faciles à quantifier que les mesures de niveau de protéines. D' autres marqueurs de sénescence peuvent également être évalués, y compris les lésions de l' ADN nucléaire persistante foyers, appelés segments d'ADN avec des altérations de la chromatine de renfort sénescence (ADN-CICATRICES) 18 et divers autres marqueurs 3, 19, 20.
Ici, nous décrivons des techniques communes pour induire la sénescence dans les cellules en culture et aussi pour mesurer plusieurs marqueurs de sénescence, y compris SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, et la protéine et l'ARNm de sénescencence molécules-associé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit des méthodes pour réplicative induite et l'ADN des dommages sénescence en utilisant des fibroblastes diploïdes humains. En outre, les techniques de quantification de la protéine et les taux d'ARNm de différentes protéines associées à la sénescence sont incluses, ainsi que pour la coloration SA-β-gal et pour le marqueur d'ADN dommages γ-H2AX. Ces protocoles peuvent être largement utilisés pour évaluer phénotypes sénescentes in vitro et in vivo, bien q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros des Instituts nationaux de la santé, l'Institut national sur le vieillissement. Les auteurs tiennent à remercier Myriam Gorospe et Kotb Abdelmohsen pour de nombreuses discussions utiles sur la sénescence et Kotb Abdelmohsen pour la lecture aussi critique du manuscrit. Nous remercions également les membres de notre laboratoire, en particulier Douglas Dluzen pour la lecture critique du manuscrit.
Materials
| 16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
| Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
| Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
| Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
| ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
| DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/ml in dH2O |
| GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000-5,000 dilution |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
| Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
| Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
| Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
| N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
| p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
| p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
| p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
| phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2000 dilution |
| POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 | |
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