Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza

Summary

senescenza cellulare, lo stato irreversibile di arresto del ciclo cellulare, può essere indotta da vari stress cellulari. Qui, descriviamo i protocolli per indurre la senescenza e metodi per valutare cellulare marcatori di senescenza.

Abstract

In risposta allo stress cellulare o danno, le cellule proliferanti possono indurre un programma specifico che avvia uno stato di arresto del ciclo cellulare a lungo termine, chiamato senescenza cellulare. Accumulo di cellule senescenti verifica con l'invecchiamento organismal e mediante coltura continua in vitro. cellule senescenti influenzano molti processi biologici, compreso lo sviluppo embrionale, la riparazione dei tessuti e la rigenerazione, soppressione del tumore, e l'invecchiamento. Caratteristiche di cellule senescenti includono, ma non sono limitati a, maggiore attività β-galattosidasi senescenza-associato (SA-β-gal); p16 ^INK4a, p53, p21 e livelli; Livelli più elevati di danno al DNA, tra γ-H2AX; la formazione di senescenza associata Eterocromatina Foci (SAHF); e l'acquisizione di un senescenza associata secretoria fenotipo (SASP), un fenomeno caratterizzato dalla secrezione di alcune citochine pro-infiammatorie e molecole di segnalazione. Qui, descriviamo i protocolli sia per replicativo esenescenza DNA danno-indotta in cellule coltivate. Inoltre, si segnalano tecniche per monitorare il fenotipo senescente utilizzando diversi marcatori senescenza-associata, tra SA-β-gal, γ-H2AX e SAHF colorazione, e per quantificare i livelli di proteine ​​e mRNA di regolatori del ciclo cellulare e fattori SASP. Questi metodi possono essere applicati alla valutazione della senescenza in vari modelli e tessuti.

Introduction

Più di mezzo secolo fa, Hayflick e colleghi hanno descritto come le cellule proliferano non trasformata in cultura, ma solo per un periodo limitato di tempo ^1. coltura a lungo termine di fibroblasti umani ha causato le cellule per fermare la proliferazione; tuttavia, erano metabolicamente attiva, e questo è stato chiamato senescenza cellulare. Senescenza può essere utile per inibire la tumorigenesi, ma può anche essere dannoso, in quanto si ritiene contribuiscano alla perdita di capacità rigenerativa che si verifica con l'invecchiamento ^{2, 3.} Cellule senescenti hanno dimostrato di accumularsi nei tessuti come esseri umani ⁴ anni e sono stati implicati in una serie di processi biologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, la riparazione dei tessuti e l'infiammazione legata all'età ^2.

passaging continuo di cellule in coltura induce senescenza replicativa, che è stato collegatodi telomero attrito e instabilità genomica. Varie sollecitazioni cellulari, comprese danno al DNA e oncogeni, possono anche causare senescenza ^3. Senescenza causata da fattori diversi telomere attrito è spesso chiamato da stress o senescenza prematura e dipende generalmente dalla p16 ^INK4A / Rb pathway ^5. Sebbene proliferanti, cellule non trasformate compaiono tipicamente mandrino in forma, cellule senescenti possono essere identificati come aventi determinate caratteristiche, tra cui una TV, ampio morfologia e una maggiore attività β-galattosidasi senescenza-associato (SA-β-gal) (Figure 1 e 2). Cellule senescenti accumulano anche marcatori di danno del DNA, tra cui γ-H2AX (figura 3) ^6, e, potenzialmente, senescenza associata eterocromatina foci (SAHF) (Figura 4) ^7. cellule senescenti hanno livelli elevati di regolatori del ciclo cellulare, tra cui p 16 ^(INK4A p16) e / o p21 e p53 (Figura 5) ^{8, 9.} Inoltre, i dati recenti hanno dimostrato che le cellule senescenti possono avere effetti non autonomi secernendo un numero di citochine pro-infiammatorie e chemochine chiamato senescenza associata secretoria fenotipo (PSAS) ^10. Sebbene questo fenomeno SASP può variare da tipo cellulare a tipo cellulare, in generale, è dimostrato da un aumento di interleuchina-6 (IL-6), IL-8, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF), alla crescita α regolata oncogene (GRO-α) e GRO-β, tra gli altri (Figura 6). Lo stress particolare o danni che induce senescenza possono anche influenzare il fenotipo secretorio ^{11, 12, 13.} SASP può essere rilevata misurando i livelli di proteine ​​secrete mediante ELISA o array citochine / proteinas = "xref"> ^{10, 14.} Sebbene i meccanismi post-trascrizionali possono regolare i livelli proteici SASP ^{11, 15, 16, 17,} cambiamenti nei livelli di mRNA possono essere rilevati anche in molti casi. Questi cambiamenti sono generalmente più sensibili e più facile da quantificare rispetto misurazioni del livello di proteine. Altri marcatori senescenti possono anche essere valutati, compresi persistente danno al DNA foci nucleari, detti segmenti di DNA con alterazioni della cromatina rinforzo senescenza (DNA-SCARS) ^18, e vari altri marcatori ^{3, 19, 20.}

Qui, descriviamo comuni tecniche per indurre senescenza in cellule in coltura e per la misura diversi marcatori di senescenza, tra SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, e la proteina e mRNA di senescemolecole SNO-associata.

Protocol

1. Induzione replicativo senescenza Disgelo basso passaggio fibroblasti diploidi umane (ad esempio, WI-38 e IMR-90) o altre linee cellulari. NOTA: Qui, fibroblasti diploidi umane sono stati usati, ma questi protocolli può essere utilizzato per valutare la senescenza in altri tipi di cellule, come cellule endoteliali, epiteliali, o cellule staminali mesenchimali. condizioni di coltura possono essere ottimizzate per i diversi tipi cellulari utilizzati a causa dei diversi tassi di crescita o con…

Representative Results

Le figure 2 – 6 mostrano risultati rappresentativi SA-β-gal colorazione; colorazione per γ-H2AX e SAHF; valutazione dei livelli di proteina di p16 INK4A, p21, e p53; e mRNA e di proteina di molecole senescenti-associata. Aumento della colorazione SA-β-gal verifica con replicativa e danni al DNA indotto senescenza. Inoltre, osservare i cambiamenti morfologici che si verificano con senescenza. Cellule diventano allargata e piatta rispetto alla comparsa del ma…

Discussion

Qui, abbiamo descritto metodi per replicativo e danno del DNA senescenza indotta utilizzando fibroblasti diploidi umane. Inoltre, le tecniche di quantificazione delle proteine ​​e livelli di mRNA di varie proteine ​​senescenza associate sono inclusi, così come colorazione per SA-β-gal e per il marcatore DNA-danneggiamento γ-H2AX. Questi protocolli possono essere ampiamente utilizzati per valutare fenotipi senescenti sia in vitro che in vivo, sebbene esistano molti avvertimenti per la caratte…

Materials

16% Tris-glycine gels	Invitrogen	XP00160BOX
Acid-Phenol ChCl3	Ambion	AM9720
Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A11031	1:300 dilution
Cell lifters	Corning Inc.	3008	Cell scraper
ECL anti-mouse HRP linked antibody	Amersham	NA931V
ECL Plus Western Blotting Substrate	Pierce	32132	ECL
DAPI	Molecular Probes	MP01306	stock 5 mg/ml in dH2O
GAPDH antibody	Santa Cruz	sc-32233	1:1,000-5,000 dilution
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody	Abcam	1220	1:500 dilution
Human IL-6 Quantikine ELISA assay	R&D systems	D6050
Human IL-8 Quantikine ELISA assay	R&D systems	D8000C
Human GROa Quantikine ELISA assay	R&D systems	DRG00
N-N-dimethylformamide	Sigma	D4551	DMF
p16 monoclonal antibody	BD Biosciences	51-1325gr	1:500 dilution
p21 monoclonal antibody	Millipore	05-345	1:750 dilution
p53 monoclonal antibody	Santa Cruz	sc-126	1:500 dilution clone DO-1
phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody	Cell Signaling	9719	1:2000 dilution
POWER SYBR-green PCR master mix	Applied Biosystems	4367659
Pre-stained molecular weight markers	Biorad	161-0374
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
PVDF membrane	Thermo Scientific	88518
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling	9860
TRIzol	Ambion/Life Tech	10296028