Method Article

안 체외에서 결핵 병변에서 약물 침투를 예측하는 Caseum Binding Assay

DOI:

10.3791/55559

⸱

May 8th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Public Health Research Institute Centre, New Jersey Medical School, Rutgers, 2Tuberculosis Research Section, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, NIAID, NIH

In This Article

Summary

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여기에서는 폐결핵 병변 및 충치에서 caseum에 대한 약물 결합을 측정하기위한 신속한 평형 투석 (RED) 방법에 대해 설명합니다. 프로토콜은 또한 caseum에 효과적인 대리 대리인 거품 마크로파지 파생 매트릭스와 함께 사용됩니다.

Abstract

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결핵성 질병 퇴치는 복잡한 폐 병변의 여러 층을 침투 할 수있는 약물 요법을 필요로합니다. 충치 및 병변의 caseous 코어의 약물 분포는 일반적으로 persisters로 알려진 약물 내성 박테리아의 subpopulations을 보유하기 때문에 특히 중요합니다. 결핵 병변에서 약물 침투를 측정하기위한 기존의 방법 은 생체 분석 또는 영상 기술과 결합 된 비용이 많이 들고 시간 소모적 인 생체 내 약물 동태 학 연구를 필요로한다. Caseum macromolecules에 결합하는 약물의 in vitro 측정은 이러한 결합이 caseum을 통한 약물 분자의 수동 확산을 방해하기 때문에 그러한 기술의 대안으로 제안되었다. 신속한 평형 투석은 혈장 단백질 및 조직 결합 연구를 수행하는 빠르고 안정적인 시스템입니다. 이 프로토콜에서 우리는 빠른 평형 투석 (RED) 장치를 사용하여 excis 인 caseum의 균질 액에 대한 약물 결합을 측정했습니다병변 결핵 감염 토끼 공동 에드. 이 프로토콜은 또한 caseum 대신 사용할 THP-1 식세포로드 지질에서 대리 매트릭스를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 caseum / 대리 결합 분석은 결핵 신약 개발에 중요한 도구입니다 및 기타 질병으로 인한 병변이나 농양의 약물 분포를 연구하기 위해 적용 할 수 있습니다.

Introduction

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폐결핵병의 치료에는 약물을 여러 종류의 병변으로 효과적으로 분배해야합니다. Necrotic 병변과 충치는 약물 내성 또는 '영구'박테리아의 subpopulations을 보유 caseous 센터가 포함되어 있습니다. 1 , 2 공동 질환은 열등한 치료율과 나쁜 예후와 관련이 있습니다. 3 , 4 이전의 연구들은 정량적 및 영상 기법을 사용하여 caseum을 투과시키는 능력이 약물 종류에 따라 크게 다르다는 것을 보여주었습니다. 그러나 이러한 방법은 느리고 지루한 동물 감염 모델을 사용해야합니다. 생체 외 caseum에 대한 약물 결합을 측정하는 in vitro 분석이 설계되었습니다. 이 결합은 육아종 육아종의 약물 침투와 역으로 상관 관계가 있으며, 따라서예측 도구로 사용됩니다. 7

평형 투석은 혈장 단백질 결합 연구에 대한 금 기본 접근법으로 간주됩니다. 빠른 평형 투석 (RED) 장치는 그러한 분석을 수행하는 데 빠르고, 사용하기 쉽고 신뢰할....

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Protocol

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모든 동물 연구는 메릴랜드 주 베데스다의 NIAID (NIH) 기관 동물 보호 및 사용위원회의 승인을 받아 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용 안내서에 따라 수행되었습니다. 결핵과 관련된 모든 연구는 생물 안전성 봉쇄 수준 3 (BSL-3)의 실험실에서 수행되었습니다.

1. 토끼 감염 모델 및 Caseum 수집

  1. 이전에 설명한대로 코에 에어로졸 노출 시스템을 사용하여 M. tuberculosis로 뉴질랜드 흰 토끼를 감염시킵니다. 12 , 13 12-16 주 동안 감염이 진행되도록하십시오. 토끼에게 35 mg / kg ketamine과 5 mg / kg xylazine을 근육 내 주사하고, 0.22 mL / kg pentobarbital sodium과 phenytoin sodium을 정맥 내로 안락사시키고 부검을 진행하십시오.
  2. 족집게와 메스를 사용하여 가슴에서 폐를 제거하십시오.vity. 각 폐 엽으로부터 메스를 사용하여 개별 공동 큰 괴사 육아종 해부. 조심스럽게 캐비티 및 육아종 벽에서 caseum을 긁어. 사용 전까지 -20 ℃에서 2 ㎖의 스크류 캡 튜브에....

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Results

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이 프로토콜을 사용하여 우리는 침투성 caseum에서 예상되는 효율성을 위해 수백 가지의 결핵 약물 개발 화합물을 테스트했습니다. 그림 1 은 RED 분석의 기본 개념을 시각화합니다. RED 인서트의 투석 막은 언 바운드 소분자가 기증자 우물에서 수용기 우물로 확산되도록하여 결국 두 구획 사이의 평형을 이룹니다. 단백질이나 지질과 같은 거대 분자에 결합 된 작은 분자는 기증자에 잘 포획됩니다. 두 구획의 시료를 정량 분석하면 caseum 또는 대리 기질의 각 작은 분자의 결합되지 않은 분율 ( f u )을 계산할 수 있습니다. 이 분획은 생체 내 caseum의 약물 침투와 직접적인 상관 관계가있는 것으로 나타났습니다. 7 그림 2는 MALDI (매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화) 질량 분석법metry 화상.......

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Discussion

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결핵에 감염된 환자의 폐 괴사 성 병변 및 충치는 약물 치료에 저항력이있는 세균 집단을 포함합니다. 이러한 구조물의 핵심은 세포 외 환경에서 이러한 잔류 물을 보유하는 데 특히 책임이있다. 이러한 원격 위치에 항균제를 유리하게 분배하는 것이 결핵약 효능의 중요한 결정 인자로 여겨진다. 이 프로토콜의 유효성을 검증하기 전에, 소변 병변에서 약물 발견 화합물의 분포를 예측할 수 있는 in vitro 기술은 존재하지 않았다. 결과적으로,이 중점 병변에서의 약물 분포 평가는 동물 감염 모델, 병변 중심 약동학 연구 및 MALDI 질량 분석 이미징 기술에 크게 의존했다. 5 , 17

시험 관내 분석에서 그는다시는 생체 내 약물 동력학 연구의 번거 로움과 비용없이 결핵 병변에 약물 침투를 예측하는 빠르고 효과적인 방법입니다. 프로토콜은.......

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Disclosures

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더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

Acknowledgements

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Bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid 및 tedizolid를 제공 한 Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X 및 Trius Therapeutics에 감사드립니다. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li 및 Danielle Weiner는 MALDI 분석, 생물 분석 방법, caseum 대리인의 준비, 화학 합성 및 토끼 caseum의 분리에 대한 지원을 제공했습니다. 이 작업은 Bill and Melinda Gates Foundation, # OPP1044966 및 OPP1024050 보너스, V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072 및 Bill and Melinda Gates Foundation의 공동 기금 및 우수 센터를위한 Wellcome Trust의 기금으로 수행되었습니다 개발 도상 세계의 질병에 대한 리드 최적화를 위해 P. Wyatt에게

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
뉴질랜드 흰 토끼
Mycobacterium tuberculosisBEI 리소스NR-13647 
Ketathesia (케타민) 100 mg/mL C3NHenry Schein Animal Health56344
Anased (Xylazine) 100 mg/mLHenry Schein Animal Health33198
Euthasol (펜토바르비탈 나트륨 및 페니토인 나트륨) 용액 Virbac710101
THP-1 단핵 세포주ATCCATCC TIB-202
175 cm² TC-Treated Flask (T175)Fisher ScientificT-3400-175
RPMI 1640 매체 w/o 글루타민Fisher ScientificMT-15-040-CV
Hyclone 태아 소 혈청, 감마 방사선 조사 Fisher ScientificSH3091003IR
Hyclone L-글루타민, 200mMFisher ScientificSH3003401
Cellstar TC 접시, 145mm x 20mm, 통풍Fisher ScientificT-2881-1
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Fisher ScientificBP685-1
에틸렌디아민테트라아세트산SigmaE6758
올레산 Fisher ScientificICN15178101
Pierce RED 장치 재사용 가능한 베이스 플레이트Fisher ScientificPI-89811
Pierce RED 장치 삽입물, 50개/박스 Fisher ScientificPI-89809
Pierce RED 삽입 제거 도구 Fisher Scientific89812
접착 플레이트 씰Fisher Scientific08-408-240
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) 라이프 테크놀로지 10010-049
DMSO시그마472301
아세토니트릴시그마34998
메탄올시그마34860
베라파밀 하이드로클로라이드시그마V4629
디클로페낙 나트륨 염시그마93484
트리판 블루 솔루션, 0.4%Fisher Scientific15-250-061
에탄올, 200 proofFisher Scientific04-355-451
2010 Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
비드 밀 균질화 액세서리, 금속 벌크 비즈Fisher Scientific15-340-158
484R 코발트 60 조사기JL Shepard7810-484-1
INCYTO  C-Chip 일회용 혈구계Fisher Scientific22-600-100
정립 광 현미경LeicaDM1000
이진 액체 크로마토그래피 시스템Agilent1260다중 구성
질량 분석기AB Sciex4000
Covance-HN878

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
  2. Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Fron....

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Caseum Binding AssayDrug PenetrationTuberculosis LesionsRapid Equilibrium DialysisSurrogate MatrixTHP 1 MacrophagesLipid LoadingLCMS AnalysisUnbound Fraction CalculationMatrix Assisted Laser Desorption Ionization

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