アン<em>インビトロ</em>結核病変における薬物侵入を予測するカゼウム結合アッセイ
Summary
ここでは、肺結核病変および腔からのカゼムとの薬物結合を測定するための迅速な平衡透析（RED）法を説明する。このプロトコールはまた、発泡マクロファージ由来のマトリックスと共に使用され、これは、カゼムの有効な代用物である。
Abstract
結核病の根絶には、複雑な肺病変の複数の層に浸透することができる薬物レジメンが必要である。窩洞および病変の大部分のコアにおける薬物分布は、一般に害虫とも呼ばれる薬物耐性細菌の亜集団を収容するため、特に重要である。結核病変における薬剤浸透の測定のための既存の方法は、 生体分析または画像化技術に結合された経費のかかる時間のかかる生体内薬物動態研究を必要とする。この結合は、カゼムを介する薬物分子の受動的拡散を妨げるので、カゼイン高分子への薬物結合のインビトロ測定は、そのような技術の代替として提案されている。迅速な平衡透析は、血漿タンパク質および組織結合研究を行うための迅速かつ信頼性の高いシステムである。このプロトコールでは、excisであるカゼウムのホモジネートへの薬物結合を測定するために、高速平衡透析（RED）装置を使用した結核に感染したウサギの病変および腔から滲出した。このプロトコールはまた、カゼムの代わりに使用する脂質負荷THP-1マクロファージから代理マトリックスを生成する方法も記載している。このカゼウム/サロゲート結合アッセイは、結核薬の発見において重要なツールであり、他の疾患によって引き起こされる病変または膿瘍の薬物分布を研究するのに役立つことができる。
Introduction
肺結核疾患の治療には、様々なタイプの病変への薬物の効果的な分配が必要である。壊死病巣および腔は、薬剤耐性または「持続性」細菌の亜集団を有する大腸菌センターを含む。 1、2空洞病は、劣悪な治癒率と不良な予後と関連している。以前の研究では、定量的および画像技術を用いて、カゼムを浸透させる能力が薬物クラスごとに著しく異なることが示されている。しかし、これらの方法は、遅く退屈な動物感染モデルの使用を必要とする。 ex vivoカゼウムへの薬物結合を測定するインビトロアッセイを設計した。この結合は、肉芽腫の薬物浸透と逆相関することが判明し、したがって、予測ツールとして使用。 7
平衡透析は、血漿蛋白質結合研究に金標準的なアプローチとみなされています。迅速平衡透析（RED）デバイスは、そのようなアッセイを実施するための、迅速で使いやすいと信頼性の高いシステムを提供します。 8デバイスは、2つのコンポーネントで構成され：使い捨て、半透膜の垂直シリンダによって分離された2室からなる使い捨てインサート。一度に48個のインサートまで保持することができ、再使用可能なベース板。透析膜は、8 kDaの分子量カットオフ（MWCO）を有する薬物 – 高分子結合研究のために理想的です。膜区画の高い表面積対体積比は、急速透析および平衡化を可能にします。インサートとベースプレートの両方は、最小の非特異的結合のために検証されてきました。生体分析技術とRED素子の組み合わせは、Pにおける薬物の非結合画分の正確な推定を提供しますラスマ8,9
当初は血漿タンパク質結合を測定するように設計されていたが、RED装置はホモジネートを用いたいくつかの組織結合研究に用いられてきた。このプロトコールでは、壊死病変および結核感染ウサギの腔から摘出された壊死屑であるカゼムに対する薬物結合を測定する。ケース状材料の無細胞性および非血管性は、アッセイと適合する均一な懸濁液にホモジナイズすることを容易にする。
カゼウムが生産するのが面倒で、来るのが難しいことを考えると、プロトコールはまた、泡沫状マクロファージから調製された代理母材と共に使用するために検証されている。 THP-1単球由来マクロファージはオレイン酸で誘導され、それらに「泡沫」外観を与える複数の脂質体を蓄積する。これらの脂質負荷細胞を採取し、我々はcaseumへの代理として使用マトリックスを生成するために処理。この研究では、この代用マトリックスに結合するその薬剤を示した効果肉芽腫及び空洞の乾酪性コア中の薬物の浸透を妨げるインビボのプロセスを模倣、caseumに結合するとよく相関します。
Protocol
Representative Results
Discussion
結核に感染した患者の肺壊死病変および空洞には、薬物治療に対して反抗的な細菌の亜集団が含まれる。これらの構造の大部分のコアは、細胞外環境においてこれらの胞子を保持することに特に関与する。これらの離れた場所への抗菌剤の好都合な分布は、結核薬効の重要な決定要因であると考えられている。このプロトコールのバリデーションの前に、大腸病変における創薬化合物の分布?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、それぞれ、PA-824（pretomanid）、AZD5847、radezolidとtedizolid bedaquilineを提供するためのジョンソン・エンド・ジョンソン、TBアライアンス、アストラゼネカ、リブ-XとTrius治療に感謝したいです。ブレンダンプリドー、マシュー・ツィンマーマン、ステファン・ジャズウィン、エマ・レイ・フラド、ナンシールーエル、レヤン・リおよびダニエル・ウェイナー MALDI分析、生物分析方法、caseumサロゲートの調製、化学合成、およびウサギcaseumの単離と支持を提供しました。この作品は、センターオブエクセレンスのためにビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団とウェルカム・トラストからビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団、賞＃OPP1044966とOPP1024050からV・ダートイス、NIH共有計装グラントS10OD018072だけでなく、共同資金に資金調達を行いましたP・ワイヤットに発展途上国の疾患のためのリード最適化のために。
Materials
| New Zealand White Rabbits | Covance | – | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145x20mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
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