Summary
Vi presenterer en metode for å kvantifisere DNA-metylering basert på 5-metylcytosin (5-mC) dot blot. Vi bestemte oss for 5-mC nivåene under chondrocyt dedifferentiering. Denne enkle teknikken kan brukes til å raskt bestemme kondrocytfenotypen ved ACI-behandling.
Abstract
Den dedifferentiering av hyalinkondrocytter til fibroblastiske kondrocytter følger ofte monolag-ekspansjon av kondrocytter in vitro . Det globale DNA-metyleringsnivået for kondrocyter anses å være en egnet biomarkør for tap av kondrocytfenotypen. Imidlertid kan resultater basert på forskjellige eksperimentelle metoder være inkonsekvente. Derfor er det viktig å etablere en presis, enkel og rask metode for å kvantifisere globale DNA-metyleringsnivåer under kondrocyt dedifferensiering.
Aktuelle genom-brede metyleringsanalyse teknikker bygger i stor grad på bisulfitt genomisk sekvensering. På grunn av DNA-nedbrytning under bisulfittomdannelse krever disse metodene typisk et stort prøvevolum. Andre metoder som brukes til å kvantifisere globale DNA-metyleringsnivåer inkluderer høyytelsesvæskekromatografi (HPLC). HPLC krever imidlertid fullstendig fordøyelse av genomisk DNA. I tillegg er forbudt høye kostnader for HPLC iStruments begrenser HPLCs bredere anvendelse.
I denne studien ble genomisk DNA (gDNA) ekstrahert fra humane kondrocyter dyrket med varierende antall passasjer. GDNA-metyleringsnivået ble detektert under anvendelse av en metyleringsspesifikk dot-blot-analyse. I denne dot blot-tilnærmingen ble en gDNA-blanding inneholdende det metylerte DNA som skal detekteres, spottet direkte på en N + -membran som en prikk inne i et tidligere tegnet sirkulært malemønster. Sammenlignet med andre gelelektroforese-baserte blotting-tilnærminger og andre komplekse blottingprosedyrer sparer dot blot-metoden betydelig tid. I tillegg kan dotblots detektere det totale DNA-metyleringsnivå ved bruk av et kommersielt tilgjengelig 5-mC antistoff. Vi fant at DNA-metyleringsnivået varierte mellom monolag-subkulturer, og kunne derfor spille en nøkkelrolle i kondondrocyt dedifferentiering. 5-mC dot blot er en pålitelig, enkel og rask metode for å oppdage det generelle DNA-metyleringsnivået for å evaluereE kondrocyt fenotype.
Introduction
Autolog chondrocytimplantasjon (ACI) er en relativt ny, state-of-the-art prosedyre for behandling av leddbruskdefekter 1 , 2 . En av de avgjørende trinnene i ACI er amplifisering av kondrocytter via monolagskultur in vitro . Under amplifisering, taper hyalinkondrocytterene lett sin fenotype og blir dedifferentiert, noe som er uønsket for ACI-behandling 3 , 4 . For å optimalisere utfallet av ACI-behandling, bør omfanget av kondrocyt dedifferentiering bestemmes før genplantning. Det er viktig å etablere en økonomisk og rask måte å bestemme kondrocytternes status på. Foreningen mellom DNA-metylering og kondrocyt dedifferentiering har nylig tiltrukket seg mye oppmerksomhet 4 , 5 , 6 . DNA-metylering er en prosess av whI metylgrupper tilsettes DNA, noe som resulterer i omdannelse av cytosinrester til 5-metylcytosin (5-mC).
For å belyse biologien av DNA-metylering i kondrocyt dedifferentiering, er det første trinnet å evaluere DNA-metyleringsnivået av kondrocytter, som hittil har vist seg å være utfordrende. Bisulfitt genomisk sekvensering er den mest brukte teknikken for å analysere DNA-metylering 7 , 8 . I denne analysen forårsaker bisulfitt-omdannelse DNA-nedbrytning, og således må det tilveiebringes en vesentlig mengde prøve for analysen. Dessuten har høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) blitt brukt til å kvantifisere globale DNA-metyleringsnivåer 9 , 10 . HPLC-analyse krever imidlertid genomisk DNA-fordøyelse. Videre kreves avanserte og dyre eksperimentelle instrumenter. Derfor, i tillegg til den høye prisen, er disse eksperimentelle prosedyrene tidsforstyrrelseruming. Anti-5-mC antistoffer har nå blitt kommersielt tilgjengelige, noe som har skapt muligheten for immunblotting av 5-mC-holdig genomisk DNA fra komplekse genomer.
I denne rapporten ekstrahente vi genomisk DNA fra kondrocyter dyrket i en serie av monolagskulturer. Vi brukte en dot blot-analyse for å evaluere 5-mC innholdet i humane kondrocyter med forskjellige antall passasjer. Vi fant at 5-mC innhold ble økt i svært dedifferentierte kondrocytter sammenlignet med kondrocytter med lavverdig dedifferentiering. I tillegg identifiserte vi et forhold mellom dedifferentiation status og 5-mC nivåer. Endelig rapporterte vi at endringene i 5-mC innhold var assosiert med kondrocyt fenotypen. Derfor er 5-mC dot blot-analysen en pålitelig, enkel og rask metode for å oppdage DNA-metyleringsnivået i kondrocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Human Ethics Committee i Shenzhen Second People's Hospital.
1. Human Articular Cartilage Tissue Collection og Chondrocyte Culture
- Fremstilling av materialer
- Forbered Dulbeccos modifiserte eagle medium (DMEM) medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin streptomycin. Klargjør 1 mg / ml kollagenase II, 0,25% trypsin-EDTA, fosfatbuffert saltvann (PBS) og en cellefilter (40 μm nylon).
- Humant leddbruskvevssamling
- Isoler leddbrusk fra kneleddene fra giverpatienter etter traumer. Få informert samtykke fra alle deltakere.
- Dice brusk i 1-2 mm 3 stykker ved hjelp av en steril skalpell og fordøye kondrocyter fra hakket brusk med 1 mg / ml kollagenase II i DMEM ved 37 ° C i 12-16 timer.
- Filtrer den resulterende cellenL suspensjon gjennom en cellefilter (40 μm) og vask to ganger med PBS.
- Telle celler med et hemocytometer og frø med en tetthet på 20.000-30.000 celler / cm2 i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin streptomycin.
- Kultur i en inkubator ved 37 ° C.
- Monolayer kondrocyt ekspansjon
- Høst-subkonfluente celler ved bruk av 0,25% trypsin-EDTA og omplater ved en tetthet på 6 600 celler / cm 2 . Bytt mediet to ganger i uken.
- Kultur kondrocytter i monolag for opptil seks passasjer og vurder ved passasjer 1, 2, 3, 4 og 5.
2. Genomisk DNA (gDNA) Ekstraksjon
- Samle celler og resuspender i 500 μl lysisbuffer (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg / ml RNase A) per 10 millioner celler. Resuspender celler ved pipettering og rask inversjon, og inkuber deretter i 1 time ved 37 ° C.
- ENDd proteinase K ved en konsentrasjon på 160 ug / ml cellysalat og inverter blandingen kraftig. Inkuber 6 timer ved 55 ° C.
- Tilsett et volum Tris pH 7,9 mettet fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) til prøven. Vortex eller rist prøven med hånden grundig i ca 20 s.
- Sentrifuger prøven ved romtemperatur i 5 minutter ved 13.000 x g. Fjern den øvre vandige fasen og overfør laget til et nytt rør.
- Ekstraher med et lik volum kloroform for å fjerne fenol og overfør den øverste vandige fasen til et friskt rør.
- Precipitere DNA ved å tilsette 0,1 prøvevolum av 3 M natriumacetat pH 8,0 og 2 volumer 100% etanol.
- Oppbevar røret ved -20 ° C over natten for å utfelle gDNA.
- Sentrifuger prøven ved 4 ° C i 10 minutter ved 16.000 xg til pellet gDNA.
- Vask prøven tre ganger med 70% etanol og sentrifuger ved 4 ° C i 2 minutter ved 13.000 x g.
- Fjern supernatanenT forsiktig og lufttørk deretter. Resuspender DNA i 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.
3. DNA Methylering Profiling
- Bruk et DNA-metyleringskit til å utføre bisulfittomdannelsesreaksjonen ved å bruke totalt 500 ng av det genomiske DNA, i henhold til produsentens protokoll. Avløp i 10 μl elueringsbuffer (50 ng / μl).
- Utfør DNA-metyleringsprofilering ved hjelp av et kommersielt sett i henhold til produsentens protokoll.
4. Dot Blot Analysis
- Denaturer det isolerte DNA (1 mg pr. Prøve) i 0,1 M NaOH i 10 minutter ved 95 ° C. Nøytraliser DNA med 1 M NH 4 OAc på is, og fortynn deretter to ganger. Spot 2 μL av det serielle fortynnede genomiske DNA på en N + -membran.
- Blot membranen ved 80 ° C i 30 minutter.
- Blokker ikke-spesifikke antistoffbindingssteder ved å suge N + -membranen i 5% BSA i TBS-T i 1 time. Bruk en 10 cm petriskål som en reaksjonIonkammer ved romtemperatur.
- Etter vask 5 min tre ganger i TBST, inkuber membranen med et monoklonalt anti-5-metylcytosin (5: mC) monoklonalt antistoff (1: 1000) i TBS-T ved 4 ° C over natten.
- Vask membranen i 5 minutter tre ganger i TBS-T, og inkuber deretter med et sekundært antistoff, HRP-konjugert får-antimusimmunglobulin-G (IgG) (1: 5000) i TBS-T i 1 time ved romtemperatur.
- Vask membranen i 5 minutter tre ganger i TBS-T.
- Legg enzymsubstratet til membranen og inkuber i 5-10 minutter. Visualiser det sekundære antistoffsignalet ved hjelp av et kjemiluminescenssett ifølge produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chondrocytter ble dyrket i et monolag opp til passasje 6 (P6). Kondrocytter viste progressive fenotypiske endringer med suksessive passasjer av monolagskulturen. P0-kondrocytemorfologien var rund, mens cellene ble svært klemt og flatet med suksessive passasjer opp til P6 ( Figur 1 ). Denne morfologiske forandringen er typisk for kondrocyt dedifferentieringsprosessen. I mellomtiden indikerte resultatene av varmekartet at det generelle metyleringsnivået for CpG-steder økte med langvarig subkultur. 5-mC dot-blot-analysen viste videre at høyere CpG-metyleringsnivåer fulgte kondrocytutbredelsen ( figur 2 ). Disse resultatene foreslo en sammenheng mellom generelt økte metyleringsnivåer og kondrocyt dedifferensiering.
Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: 5-mC-spesifikk dot blot-analyse av gDNA av kondrocytter. Genomisk DNA ble isolert fra kondrocyter etter varierende antall passasjer. Progressivt forhøyede 5-mC-nivåer ble observert. 200 ng, 100 ng, 50 ng og 25 ng gDNA ble lastet per prikk. ( A ) Bilde av 5-mC-spesifikk dot blot; ( B ) Dotintensitetsanalyse av ImageJ. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chondrocyt dedifferentiation in vitro kompromitterer svært utfallet av ACI i behandlingen av brusk defekt reparasjon 11 , 12 . For å optimalisere ACI-utfallet er det avgjørende å unngå bruk av dedifferentierte kondrocytter 13 . Studier har antydet at generelt DNA-metyleringsnivå er assosiert med omfanget av kondrocyt dedifferensiering 4 , 6 . Det er således avgjørende å etablere en pålitelig og rask metode for å oppdage den generelle DNA-metyleringsstatusen for kondrocytene før den kliniske applikasjonen.
For å oppdage generelle DNA-metyleringsnivåer i dedifferentierte humane kondrocytter kunne vi måle 5-mC-nivået i serielt passerte chondrocytter. 5-mC er resistent mot deaminering ved bisulfittbehandling. Denne egenskapen ble utnyttet for å analysere DNA-cytosinmetyleringsmønstre ved bruk av tHan-bisulfitt-sekvenseringsmetode 14 . Bisulfitt genomisk sekvensering og metyleringsfølsom restriksjonsfordøyelse har blitt betraktet som gullstandardteknologi for påvisning av DNA-metylering 15 , 16 . Disse tilnærmingene kan identifisere 5-mC med enkeltbasepar resolusjon. Den største ulempen ved bisulfitt-sekvensering er imidlertid DNA-nedbrytning under bisulfitt-omdannelse. Hvis denne tilnærmingen ble brukt til å vurdere kondrocyt dedifferensiering, ville det resultere i sløsing med forplantede kondrocytter for ACI. HPLC er en annen praktisk metode for å kvantifisere globale DNA-metyleringsnivåer, men det er bare egnet for laboratorier med HPLC-utstyr. Behovet for større prøvevolumer eller moderne utstyr gjør dermed disse tilnærmingene upraktiske for rutinemessig 5-mC-nivå testing i typiske kliniske laboratorier.
Den kommersielle tilgjengeligheten av 5-mC antistoff gir muligheten til å detektereGenerelle DNA-metyleringsnivåer ved bruk av en dot blot-analyse. Sammenlignet med andre blotting teknikker, er 5-mC dot blot en enklere prosedyre, som ikke krever verken store mengder gDNA eller elektroforese. I tillegg er instrumentene tilgjengelige i moderat utstyrt laboratorier. Derfor bør 5-mC dot blot-metoden brukes som en alternativ tilnærming til DNA-metyleringsanalyse.
I denne rapporten identifiserte vi en sammenheng mellom høyere 5-mC nivåer og kondrocyt dedifferentiering; 5-mC-nivåene økte med økende subkulturpassasje. Våre funn tyder på at 5-mC kan være nært involvert i dedifferentiering forårsaket av monolayer kondrocyt ekspansjonsforhold. Viktigst, vi fant høyere 5-mC nivåer var assosiert med tap av kondrocyt fenotype, som forhindrer bred anvendelse av ACI for å reparere bruskdefekter. Derfor viser studienesultatene at 5-mC dot blotting kan være en pålitelig måte å måle omfanget avChondrocyt dedifferensiering, spesielt når større antall prøver og mindre mengder gDNA skal analyseres.
For å kunne anvende dot blot-metoder til DNA-metyleringsanalyse, er nøkkelproblemet som må vurderes, kvaliteten på DNA-prøven. Derfor er det kritiske trinnet i 5-mC-deteksjon via dot blot det genomiske gDNA-ekstraksjonstrinnet. Vi foreslår at forskere bruker et kommersielt tilgjengelig gDNA-ekstraksjonssett for å maksimere gDNA-konsentrasjon og renhet. I tillegg bør DNA-prøven lastes på en nylonmembran. Et annet viktig problem er å sikre at DNA-prøven har blitt immobilisert og absorbert fullt av nylonmembranen.
Teknikken vi beskriver her gir oss muligheten til å utføre flere analyser til laveste pris. En ytterligere fordel med denne tilnærmingen er dens avhengighet av enkelt og rimelig utstyr for å utføre analysen og tolke resultatene. Det kan også brukes til å sammenligne slektningerForskjeller i globale metyleringsnivåer mellom 2 eller flere prøver. Imidlertid kan denne analysen ikke brukes for presis kvantifisering av DNA-metyleringsnivåer eller for å bestemme CpG-metyleringsstatusen for en spesifikk DNA-sekvens. I tillegg har denne metoden begrenset følsomhet, da metyleringsstatusen ikke kan nøyaktig detekteres i gDNA-prøver under 50 ng. Selv om denne metoden gir en kvalitativ analyse av global DNA-metylering, kan det føre til falske positive resultater hvis det utføres feil.
Sammendrag 5-mC dot blot er en pålitelig, enkel og rask metode for å detektere det generelle DNA-metyleringsnivået for å evaluere kondrocytfenotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: Natural Science Foundation of China (nr. 81572198; nr. 81260161; nr. 81000460); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr. 2015A030313772); Kina Postdoktoravhengighetsfond finansiert prosjekt (nr. 2013M530385); The Medical Research Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr. A2016314); Shenzhen Science and Technology Prosjekter (nr. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).