توضح هذه المخطوطة كفاءة، والتسليم غير فيروسي مير إلى الخلايا البطانية التي كتبها ناقل PEI / MNP ومغنطة بهم. وهكذا، بالإضافة إلى التعديل الوراثي، ويسمح هذا النهج لتوجيه الخلايا المغناطيسي MRI والكشف. هذه التقنية يمكن استخدامها لتحسين خصائص المنتجات خلية العلاجية.
حتى الآن، فإن العلاجات الجراحية والدوائية المتاحة لأمراض القلب والأوعية الدموية (الأمراض القلبية الوعائية) محدودة وغالبا ما الملطفة. وفي الوقت نفسه، الجينات والخلايا العلاجات هي النهج البديلة واعدة للغاية لعلاج الأمراض القلبية الوعائية. ومع ذلك، فإن التطبيق السريري واسعة من العلاج الجيني يقتصر إلى حد كبير بسبب عدم وجود أنظمة توصيل الجينات المناسبة. تطوير ناقلات توصيل الجينات المناسبة يمكن أن توفر حلا للتحديات الراهنة في العلاج بالخلايا. وعلى وجه الخصوص، السلبيات الموجودة، مثل كفاءة محدودة ومنخفضة الاحتفاظ الخلايا في الجهاز المصاب، يمكن التغلب عليها عن طريق الهندسة الخلية المناسبة (أي الوراثية) قبل الزرع. يصف بروتوكول المعروضة تعديل عابر فعالة وآمنة من الخلايا البطانية باستخدام جسيمات متناهية الصغر polyethyleneimine مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic المغناطيسي (PEI / MNP) المستندة إلى متجه التسليم. أيضا، يتم تعريف خوارزمية والأساليب لتوصيف الخلية. وintracellu ناجحةوقد حقق تسليم لار من الرنا الميكروي (مير) في الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVECs) دون التأثير على بقاء الخلية، وظائف، أو الاتصالات بين الخلايا. وعلاوة على ذلك، فقد أثبت هذا النهج لإحداث تأثير وظيفي قوي في خارجية المنشأ قدم مير. الأهم من ذلك أن تطبيق هذا ناقل القائمة MNP-يضمن مغنطة الخلية، مع المرافق إمكانيات استهداف المغناطيسي MRI وتتبع غير الغازية. وهذا قد تقدم أساسا لتسترشد مغناطيسيا، علاجات الخلايا المعدلة وراثيا التي يمكن رصدها غير جراحية مع التصوير بالرنين المغناطيسي.
الجينات والعلاج بالخلايا هي أدوات قوية لديها القدرة على حل التحديات الراهنة في علاج الأمراض القلبية الوعائية. وعلى الرغم من أن كلا من هذين النهجين يجري حاليا اختبارها في التجارب السريرية، فهي ليست مستعدة بعد للالتطبيق السريري واسعة 1. والجدير بالذكر أن نهج مشترك لمواجهة التحديات من الجينات والعلاج بالخلايا هو تطوير ناقلات توصيل الجينات متعددة الوظائف مناسبة لتطبيق السريرية. عدم وجود أنظمة توصيل الجينات آمنة وفعالة هو مصدر القلق الرئيسي من العلاج الجيني. في الوقت نفسه، والهندسة الوراثية من المنتجات الخلوية قبل الزرع يمكن التغلب على التحديات الخطيرة للعلاج الخلايا، مثل انخفاض الكفاءة (على سبيل المثال، في مجال القلب، ويتحقق فقط ~ 5٪ من تحسين وظيفي بعد الخلايا الجذعية زرع 1 ) وضعف الاحتفاظ / engraftment في موقع الإصابة (أي الاحتفاظ خلية تنخفض 5-10٪ في غضون دقائق إلى ساعات بوالحادي والتطبيق، بغض النظر عن مسار إدارة 2، 3، 4).
حتى الآن، ناقلات فيروسية تتجاوز الى حد كبير أنظمة غير الفيروسية من حيث الكفاءة، مما أدى إلى تطبيقها على نطاق أوسع في التجارب السريرية (~ 67٪) 5. ومع ذلك، والمركبات الفيروسية تحمل مخاطر جسيمة، مثل المناعية (والاستجابة الالتهابية لاحقة، مع مضاعفات خطيرة)، قدرة التوريم، والقيود في حجم المادة الوراثية تنفيذ 6. بسبب هذه المخاوف المتعلقة بالسلامة وارتفاع تكاليف الإنتاج ناقلات فيروسية، واستخدام أنظمة غير الفيروسية هو الأفضل في بعض الحالات 7 و 8. انها مناسبة خاصة للاضطرابات التي تتطلب التصحيح الجيني عابرة، مثل التعبير عن عوامل النمو السيطرة على الأوعية الدموية (على سبيل المثال، لعلاج الأمراض القلبية الوعائية) أو deliveراي من اللقاحات.
في مجموعتنا، تم تصميم نظام التسليم عن طريق الجمع بين تشعبت 25 كيلو دالتون polyethyleneimine (PEI) وجزيئات أكسيد الحديد مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic (MNP) تربطهم البيوتين streptavidin التفاعل 9. هذه النواقل هو أداة محتملة للهندسة الوراثية للخلايا، مما يسمح للمغنطة في وقت واحد من قبل الزرع. يوفر هذا الأخير أساسا لالمغناطيسي التوجيه / الاحتفاظ بها، وهي واعدة خاصة في الوقت الحاضر، وأساليب الاستهداف المتقدمة المغناطيسي ويجري حاليا وضع بنجاح (10). وعلاوة على ذلك، مما أدى الخلايا تستجيب مغناطيسيا لديها القدرة على أن تكون غير جراحية رصدها بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) أو التصوير الجسيمات المغناطيسية 11 و 12.
في حالة حدوث الموجه PEI / MNP، البولي أمينات يضمن التكثيف الحمض النووي، وبالتالي الحماية من عامل المهينة الصورة، استيعاب ناقلات في الخلايا، وendosomal الهروب 5. وMNPs تكمل خصائص جزيرة الأمير إدوارد، وليس فقط من حيث التوجيه المغناطيسي، ولكن أيضا عن طريق الحد من المعروف PEI سمية 7 و 13 و 14. سابقا، تم تعديل PEI / MNP خصائص ناقلات من حيث الكفاءة والتسليم (أي PDNA وميرنا) والسلامة باستخدام الخلايا الليفية والخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان 15 و 16.
في هذه المخطوطة، يوصف بروتوكول مفصلة على تطبيق مبادرة التعليم الفلسطينية / MNPs لتوليد الخلايا المعدلة ميرنا 17. لهذا الغرض، وتستخدم HUVECs وتمثل نموذجا أنشئت لفي المختبر الأوعية الدموية. فهي صعبة ل transfect وعرضة للتأثير السام 18، 19،الحمار = "XREF"> 20. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم خوارزمية لتقييم مثل هذه الخلايا في المختبر، بما في ذلك الاستهداف، والاتصالات بين الخلايا، وكشف التصوير بالرنين المغناطيسي.
يتم تقديم إنتاج خلايا معدلة وراثيا محملة النانوية مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic لتوجيهاتهم مزيد من التحكم مغناطيسيا في البروتوكول الحالي. التطبيق الناجح لهذه الاستراتيجية تسمح لتسوية بعض الصعوبات من العلاج بالخلايا، مثل انخفاض الاحتفاظ والفقراء engraftment في المنط?…
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر G. فولدا (مركز المجهر الإلكتروني، جامعة روستوك، ألمانيا) للدعم الفني في الحصول على الصور TEM النانوية مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic تصفيتها وفي إجراء تحليل الأشعة السينية الخاصة بهم. وأيد الأعمال التي تقوم بها في RTC روستوك من قبل الوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث ألمانيا (FKZ 0312138A، FKZ 316159 وVIP + 03VP00241) والدولة كروا مكلنبورغ الغربية مع الصناديق الهيكلية للاتحاد الأوروبي (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 وكلية العلوم التربوية / IV-BM-B35-0010 / 12) والتي DFG (DA 1296-1)، والرطوبة، مؤسسة، ومؤسسة القلب الألمانية (F / 01/12). وأيد فرانك ويخورست من قبل برنامج أبحاث الاتحاد الأوروبي FP7 "Nanomag" FP7-NMP-2013-الكبيرة-7.
PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | Containing Sephadex G-25 Medium |
Ninhydrin Reagent solution 2% | Sigma Aldrich | 7285 | |
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
Microplate reader Model 680 | Bio-Rad | ||
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega | Z5481 | |
Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45µm |
Libra 120 transmission electron microscope | Zeiss | Acceleration Voltage 120KV | |
Sapphire X-ray detector | EDAX-Amatek | ||
Cell culture plastic | TPP | ||
NHS-Esther Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
NHS-Esther Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
Cy5 miRNA Label IT kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
Biotin Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
Collagense Type IV Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
Endothelial growth medium, EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
anti-PECAM-1 antibody | Santa Cruz | sc-1506 | |
MS MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Scientific | L10119 | |
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript |
Pre-miR miRNA Precursor Molecules – Negative Control | Thermo Scientific | AM17110 | "scr-miR" in the manuscript |
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor | Thermo Scientific | AM10916 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | 4% solution in PBS |
DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 | |
NucleoSpin RNA isolation Kit | Machery-Nagel | 740955 | |
mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Scientific | AM1560 | |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
hsa-miR-92a TaqMan assay | Thermo Scientific | 000431 | Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
ITGA5 TaqMan assay | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
RNU6B TaqMan assay | Thermo Scientific | 001093 | |
18S rRNA Endogenous Control | Thermo Scientific | 4333760F | |
Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | |
CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
BSA | Sigma Aldrich | ||
MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
7.1 Tesla animal MRI system | Bruker Corporation | A7906 | |
ImageJ software | National Institutes of Health | upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH) | |
MPS device | Bruker Biospin | ||
Matlab software | Mathworks | ||
Ring Neodym Magnet | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm; remanescence is ~1.3T, coercivity ≥ 955 kA/m |
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Scientific | C10340 | |
FluorSave Reagent | Merck | 345789 | |
Ultrasonic bath | Bandelin electronic | Type: RK 100 SH |