Dit manuscript beschrijft de efficiënte, niet-virale aflevering van miR aan endotheelcellen door een PEI / MNP vector en de magnetisatie. Dus behalve genetische modificatie, deze benadering voor magnetische cellen leiding en MRI detecteerbaarheid. De techniek kan worden gebruikt om de kenmerken van de therapeutische cel producten te verbeteren.
Tot op heden, de beschikbare chirurgische en farmacologische behandelingen voor hart- en vaatziekten (HVZ) zijn beperkt en vaak palliatieve. Tegelijkertijd, gentherapie, celtherapie zijn veelbelovende alternatieve benaderingen voor CVD behandeling. Echter, de brede klinische toepassing van gentherapie sterk beperkt door het gebrek aan geschikte gen-afgiftesystemen. De ontwikkeling van geschikte genafleveringsvectoren kan een oplossing voor de huidige problemen in cel therapie. Met name bestaande nadelen, zoals beperkte efficiëntie en lage retentietijd van cellen in het beschadigde orgaan, kunnen worden overwonnen door geschikte cel techniek (dwz genetische) vóór transplantatie. De gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte en veilige tijdelijke modificatie van endotheelcellen behulp polyethyleenimine superparamagnetische magnetische nanodeeltjes (PEI / MNP) gebaseerde afleverende vector. Ook het algoritme en werkwijzen voor cellulaire karakterisatie gedefinieerd. De succesvolle intracellular levering van microRNA (miR) in humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) is verwezenlijkt zonder dat cellevensvatbaarheid, functionaliteit of intercellulaire communicatie. Bovendien werd deze aanpak blijkt een sterke functionele effect geïntroduceerde exogene miR veroorzaken. Belangrijk is dat de toepassing van deze MNP-gebaseerde vector verzekert cel magnetisatie, met bijbehorende mogelijkheden magnetische targeting en niet-invasieve MRI tracing. Dit kan als basis voor het magnetisch geleid genetisch gemanipuleerde cellen therapeutica die niet-invasief kan worden gevolgd met MRI te verschaffen.
Gene en celtherapie zijn krachtige instrumenten die de potentie heeft om de huidige uitdagingen in de CVD behandeling op te lossen hebben. Ondanks het feit dat beide benaderingen worden momenteel getest in klinische studies, zijn ze nog niet klaar voor brede klinische toepassing 1. Met name een gemeenschappelijke benadering van de uitdagingen van gen- en celtherapie te pakken is om multifunctionele genafgifte vectoren die geschikt zijn voor klinische toepassing te ontwikkelen. Het gebrek aan veilige en efficiënte genafgifte systemen is de belangrijkste zorg van gentherapie. Tegelijkertijd, de genetische manipulatie van cellulaire producten voorafgaand aan transplantatie de grote uitdagingen van celtherapie, zoals lage efficiëntie (bijvoorbeeld in het cardiale gebied slechts ~ 5% functionele verbetering wordt bereikt na stamceltransplantatie 1 kon overwinnen ) en slechte retentie / implantatie op de plaats van letsel (dat wil zeggen, daalt celretentie dan 5-10% binnen minuten tot uren post-toepassing, ongeacht de toedieningsweg 2, 3, 4).
Tot op heden virale vectoren aanzienlijk overschrijdt niet-virale systemen qua efficiëntie, wat heeft geleid tot bredere toepassing in klinische trials (~ 67%) 5. Echter, virale vehikels dragen ernstige risico's, zoals immunogeniteit (en de daaropvolgende ontstekingsreactie met ernstige complicaties), oncogeniciteit, en beperkingen van de omvang van de uitgevoerde genetisch materiaal 6. Vanwege deze veiligheidsproblemen en de hoge kosten van virale vectorproductie, het gebruik van niet-virale systemen de voorkeur in bepaalde gevallen 7, 8. Het is bijzonder geschikt voor kwalen die transiënte genetische correctie vereisen, zoals de expressie van groeifactoren regelen van angiogenese (bijvoorbeeld voor CVD behandeling) of delivery van vaccins.
In onze groep werd een afgiftesysteem gemaakt door combineren van 25-kDa vertakte polyethyleenimine (PEI) en superparamagnetische ijzeroxide nanopartikels (MNP) gebonden door biotine-streptavidine interactie 9. Deze vector is een potentieel middel voor de genetische manipulatie van cellen, waardoor het gelijktijdig magnetisatie voorafgaand aan transplantatie. Laatstgenoemde vormt een basis voor magnetische geleiding / retentie, die bijzonder veelbelovend tegenwoordig geavanceerde magnetische targeting technieken met succes ontwikkeld 10. Bovendien is de resulterende magnetisch responsieve cellen hebben het potentieel om niet-invasief bewaakt door magnetische resonantie beeldvorming (MRI) of magnetische deeltjes imaging 11, 12.
Bij de PEI / MNP vector, polyamine zorgt nucleïnezuur condensatie en dus bescherming tegen verval factor s, vector internalisatie in cellen en endosomale ontsnappen 5. De MNP aanvulling op de eigenschappen van PEI, niet alleen qua magnetische geleiding, maar ook door het verminderen van de toxiciteit bekende PEI 7, 13, 14. Voorheen werden PEI / MNP vector eigenschappen qua afgifterendement (dwz pDNA en miRNA) en veiligheid bepalen door fibroblasten en menselijke mesenchymale stamcellen 15, 16.
In dit manuscript wordt een gedetailleerd protocol over de toepassing van PEI / MNP's voor het genereren van miRNA-gemodificeerde cellen 17 beschreven. Hiertoe worden gebruikt HUVECs en een gevestigd model voor in vitro angiogenese vertegenwoordigen. Ze zijn moeilijk te transfecteren en zijn gevoelig voor toxische invloed 18, 19,ass = "xref"> 20. Bovendien geven we een algoritme voor dergelijke cellen in vitro, waaronder het richten, intercellulaire communicatie en MRI detectie evalueren.
De productie van genetisch gemanipuleerde cellen geladen met superparamagnetische nanopartikels voor de verdere magnetisch gestuurde geleiding heeft in het huidige protocol. De succesvolle toepassing van deze strategie maakt het mogelijk voor de oplossing van een aantal problemen van celtherapie, zoals lage retentie en slechte innesteling in de gewonde gebied 2, 3, 4, door middel van een richtbare cel product voor transplantati…
The authors have nothing to disclose.
We willen graag G. Fulda (Electron Microscopy Center, Rostock University, Duitsland) bedanken voor de technische ondersteuning bij het verwerven van TEM beelden van gefilterde superparamagnetische nanodeeltjes en in het uitvoeren van hun X-stralen analyse. De werkzaamheden op de RTC Rostock gedragen werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs en Onderzoek Duitsland (FKZ 0312138A, FKZ 316159 en VIP + 03VP00241) en de Staat Mecklenburg-Voor-Pommeren met de EU-structuurfondsen (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 en ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) en de DFG (DA 1296-1), de Damp-Foundation en de Duitse Hartstichting (F / 01/12). Frank Wiekhorst werd gesteund door de EU FP7 onderzoeksprogramma "NanoMag" FP7-NMP-2013-GROOT-7.
PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | Containing Sephadex G-25 Medium |
Ninhydrin Reagent solution 2% | Sigma Aldrich | 7285 | |
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
Microplate reader Model 680 | Bio-Rad | ||
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega | Z5481 | |
Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45µm |
Libra 120 transmission electron microscope | Zeiss | Acceleration Voltage 120KV | |
Sapphire X-ray detector | EDAX-Amatek | ||
Cell culture plastic | TPP | ||
NHS-Esther Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
NHS-Esther Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
Cy5 miRNA Label IT kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
Biotin Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
Collagense Type IV Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
Endothelial growth medium, EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
anti-PECAM-1 antibody | Santa Cruz | sc-1506 | |
MS MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Scientific | L10119 | |
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript |
Pre-miR miRNA Precursor Molecules – Negative Control | Thermo Scientific | AM17110 | "scr-miR" in the manuscript |
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor | Thermo Scientific | AM10916 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | 4% solution in PBS |
DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 | |
NucleoSpin RNA isolation Kit | Machery-Nagel | 740955 | |
mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Scientific | AM1560 | |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
hsa-miR-92a TaqMan assay | Thermo Scientific | 000431 | Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
ITGA5 TaqMan assay | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
RNU6B TaqMan assay | Thermo Scientific | 001093 | |
18S rRNA Endogenous Control | Thermo Scientific | 4333760F | |
Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | |
CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
BSA | Sigma Aldrich | ||
MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
7.1 Tesla animal MRI system | Bruker Corporation | A7906 | |
ImageJ software | National Institutes of Health | upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH) | |
MPS device | Bruker Biospin | ||
Matlab software | Mathworks | ||
Ring Neodym Magnet | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm; remanescence is ~1.3T, coercivity ≥ 955 kA/m |
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Scientific | C10340 | |
FluorSave Reagent | Merck | 345789 | |
Ultrasonic bath | Bandelin electronic | Type: RK 100 SH |