यह पांडुलिपि कुशल, मीर की गैर वायरल वितरण एक पी / एमएनपी वेक्टर और उनके चुंबकन द्वारा endothelial कोशिकाओं का वर्णन है। इस प्रकार, आनुवंशिक संशोधन के अलावा, इस दृष्टिकोण चुंबकीय सेल मार्गदर्शन और एमआरआई detectability के लिए अनुमति देता है। तकनीक चिकित्सकीय सेल उत्पादों की विशेषताओं में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
तिथि करने के लिए, हृदय रोगों के लिए उपलब्ध शल्य चिकित्सा और औषधीय उपचार (सीवीडी) सीमित हैं और अक्सर उपशामक। इसी समय, जीन और सेल चिकित्सा सीवीडी उपचार के लिए अत्यधिक होनहार वैकल्पिक दृष्टिकोण हैं। हालांकि, जीन थेरेपी के व्यापक नैदानिक आवेदन बहुत उपयुक्त जीन वितरण प्रणाली के अभाव के कारण ही सीमित है। उचित जीन डिलीवरी वैक्टर के विकास सेल थेरेपी में वर्तमान चुनौतियों के लिए एक समाधान प्रदान कर सकते हैं। इस तरह के सीमित क्षमता और घायल अंग में कम सेल प्रतिधारण के रूप में विशेष रूप से, मौजूदा कमियां में, प्रत्यारोपण के लिए (यानी, आनुवंशिक) से पहले उचित सेल इंजीनियरिंग द्वारा दूर किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक polyethyleneimine superparamagnetic चुंबकीय nanoparticle (पी / एमएनपी) आधारित वितरण वेक्टर का उपयोग कर अंतर्कलीय कोशिकाओं के कुशल और सुरक्षित क्षणिक संशोधन वर्णन करता है। इसके अलावा, एल्गोरिथ्म और सेल लक्षण वर्णन के लिए तरीकों परिभाषित कर रहे हैं। सफल intracelluमाइक्रो RNA (मीर) मानव नाल की नस endothelial कोशिकाओं में (HUVECs) की lar वितरण सेल व्यवहार्यता, कार्यक्षमता, या मायत संचार को प्रभावित किए बिना हासिल किया गया है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण भी पेश किया बहिर्जात मीर में एक मजबूत कार्यात्मक प्रभाव पैदा करने के लिए सिद्ध किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, इस एमएनपी आधारित वेक्टर के आवेदन चुंबकीय लक्ष्य-निर्धारण और गैर इनवेसिव एमआरआई ट्रेसिंग की संभावनाओं के साथ साथ, सेल चुंबकन सुनिश्चित करता है। यह चुंबकीय निर्देशित, अनुवांशिक इंजीनियर सेल चिकित्सा विज्ञान है कि एमआरआई के साथ गैर invasively नजर रखी जा सकती लिए एक आधार प्रदान कर सकते हैं।
जीन और सेल थेरेपी शक्तिशाली उपकरण सीवीडी उपचार में मौजूदा चुनौतियों का समाधान करने की क्षमता होती है। तथ्य यह है कि इन तरीकों के दोनों वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों में परीक्षण किया जा रहा होने के बावजूद वे अभी तक विस्तृत नैदानिक आवेदन 1 के लिए तैयार नहीं हैं। विशेष रूप से, एक आम दृष्टिकोण जीन और सेल थेरेपी की चुनौतियों से निपटने के लिए नैदानिक आवेदन के लिए उपयुक्त बहुआयामी जीन डिलीवरी वैक्टर विकसित करना है। सुरक्षित और कुशल जीन वितरण प्रणाली की कमी जीन थेरेपी के मुख्य चिंता का विषय है। इसी समय, सेलुलर उत्पादों की जेनेटिक इंजीनियरिंग प्रत्यारोपण इतनी कम दक्षता (जैसे, हृदय क्षेत्र में, कार्यात्मक सुधार का ही ~ 5% हासिल की है के बाद स्टेम सेल प्रत्यारोपण 1 के रूप में सेल थेरेपी की गंभीर चुनौतियों को दूर कर सकता है करने से पहले 10% घंटे पो मिनट के भीतर -) और गरीब प्रतिधारण / चोट के स्थल पर engraftment (यानी, सेल प्रतिधारण नीचे 5 बूँदेंसेंट-आवेदन, प्रशासन मार्ग 2, 3 की परवाह किए बिना, 4)।
तिथि करने के लिए, वायरल वाहक बहुत दक्षता, जो क्लिनिकल परीक्षण में उनके व्यापक आवेदन में बदल गया है के मामले में गैर वायरल सिस्टम (~ 67%) 5 से अधिक है। हालांकि, वायरल वाहनों किए आनुवंशिक सामग्री 6 के आकार में इस तरह के प्रतिरक्षाजनकता के रूप में गंभीर जोखिम, (और बाद में भड़काऊ प्रतिक्रिया, गंभीर जटिलताओं के साथ), oncogenicity, और सीमाओं ले। इन सुरक्षा चिंताओं और वायरल वेक्टर उत्पादन की उच्च लागत के कारण, गैर वायरल प्रणाली के उपयोग के कुछ मामलों 7, 8 में बेहतर है। यह विकार है कि क्षणिक आनुवंशिक सुधार की आवश्यकता है, विकास कारकों एंजियोजिनेसिस (जैसे, सीवीडी इलाज के लिए) को नियंत्रित करने की अभिव्यक्ति के रूप में या delive के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैटीकों के ry।
हमारे समूह में, एक वितरण प्रणाली branched 25 केडीए polyethyleneimine (पी) और superparamagnetic लोहे के आक्साइड नैनोकणों (एमएनपी) बायोटिन- streptavidin बातचीत 9 से साथ ही संयोजन के द्वारा डिजाइन किया गया था। इस वेक्टर कोशिकाओं की जेनेटिक इंजीनियरिंग, उनके साथ चुंबकन प्रत्यारोपण से पहले के लिए अनुमति के लिए एक संभावित उपकरण है। बाद के चुंबकीय मार्गदर्शन / प्रतिधारण, जो आजकल विशेष रूप से आशाजनक है, के रूप में उन्नत चुंबकीय लक्ष्य-निर्धारण तकनीक को सफलतापूर्वक 10 विकसित किया जा रहा के लिए एक आधार प्रदान करता है। इसके अलावा, जिसके परिणामस्वरूप चुंबकीय उत्तरदायी कोशिकाओं संभावित होना जरूरी गैर invasively चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) या चुंबकीय कण इमेजिंग 11, 12 द्वारा नजर रखी।
पी / एमएनपी वेक्टर के मामले में, polyamine अपमानजनक कारक से न्यूक्लिक एसिड संक्षेपण और इस तरह सुरक्षा सुनिश्चित करता है रों, कोशिकाओं में वेक्टर internalization, और इंडोसोम बचने के 5। MNPS पी के गुणों के पूरक हैं, न केवल चुंबकीय मार्गदर्शन के संदर्भ में, लेकिन यह भी जाना जाता पी विषाक्तता 7, 13, 14 को कम करके। इससे पहले, पी / एमएनपी वेक्टर गुण fibroblasts और मानव मीजेनकाइमल स्टेम कोशिका 15, 16 का उपयोग करके वितरण दक्षता (यानी, pDNA और miRNA) और सुरक्षा के मामले में समायोजित किया गया।
इस पांडुलिपि में, miRNA संशोधित कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए पी / MNPS के आवेदन पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल 17 में वर्णित है। इस प्रयोजन के लिए HUVECs का इस्तेमाल किया और इन विट्रो एंजियोजिनेसिस के लिए एक स्थापित मॉडल का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। वे transfect करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं और विषाक्त प्रभाव 18, 19 के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं,गधा = "xref"> 20। इसके अलावा, हम इन विट्रो में ऐसी कोशिकाओं, उनके लक्ष्यीकरण, मायत संचार, और एमआरआई का पता लगाने सहित मूल्यांकन करने के लिए एक एल्गोरिथ्म प्रदान करते हैं।
उनके आगे चुंबकीय नियंत्रित मार्गदर्शन के लिए superparamagnetic नैनोकणों के साथ भरी हुई अनुवांशिक इंजीनियर कोशिकाओं के उत्पादन मौजूदा प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया है। इस रणनीति के सफल आवेदन प्रत्यारोपण के लिए ?…
The authors have nothing to disclose.
हम फ़िल्टर किया superparamagnetic नैनोकणों की TEM छवियों को प्राप्त करने में और उनके एक्स-रे विश्लेषण करने में तकनीकी सहायता के लिए G फुल्डा (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेंटर, रॉस्टॉक विश्वविद्यालय, जर्मनी) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। काम आरटीसी रॉस्टॉक में किया जाता शिक्षा के संघीय मंत्रालय और रिसर्च जर्मनी (FKZ 0312138A, FKZ 316,159 और वीआईपी + 03VP00241) और यूरोपीय संघ स्ट्रक्चरल फंड के साथ राज्य Mecklenburg-पश्चिमी Pomerania (ESF / चतुर्थ WM-B34- द्वारा समर्थित किया गया 0030/10 और ESF / चतुर्थ बी.एम.-B35-0010 / 12) और DFG (डीए 1296-1), नम-फाउंडेशन, और जर्मन हार्ट फाउंडेशन (एफ / 01/12) द्वारा। फ्रैंक विकहोर्स्ट यूरोपीय संघ FP7 अनुसंधान कार्यक्रम "Nanomag" FP7-एन एम पी 2013-बड़ी-7 द्वारा समर्थित किया गया।
PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | Containing Sephadex G-25 Medium |
Ninhydrin Reagent solution 2% | Sigma Aldrich | 7285 | |
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
Microplate reader Model 680 | Bio-Rad | ||
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega | Z5481 | |
Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45µm |
Libra 120 transmission electron microscope | Zeiss | Acceleration Voltage 120KV | |
Sapphire X-ray detector | EDAX-Amatek | ||
Cell culture plastic | TPP | ||
NHS-Esther Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
NHS-Esther Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
Cy5 miRNA Label IT kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
Biotin Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
Collagense Type IV Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
Endothelial growth medium, EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
anti-PECAM-1 antibody | Santa Cruz | sc-1506 | |
MS MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Scientific | L10119 | |
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript |
Pre-miR miRNA Precursor Molecules – Negative Control | Thermo Scientific | AM17110 | "scr-miR" in the manuscript |
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor | Thermo Scientific | AM10916 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | 4% solution in PBS |
DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 | |
NucleoSpin RNA isolation Kit | Machery-Nagel | 740955 | |
mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Scientific | AM1560 | |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
hsa-miR-92a TaqMan assay | Thermo Scientific | 000431 | Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
ITGA5 TaqMan assay | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
RNU6B TaqMan assay | Thermo Scientific | 001093 | |
18S rRNA Endogenous Control | Thermo Scientific | 4333760F | |
Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | |
CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
BSA | Sigma Aldrich | ||
MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
7.1 Tesla animal MRI system | Bruker Corporation | A7906 | |
ImageJ software | National Institutes of Health | upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH) | |
MPS device | Bruker Biospin | ||
Matlab software | Mathworks | ||
Ring Neodym Magnet | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm; remanescence is ~1.3T, coercivity ≥ 955 kA/m |
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Scientific | C10340 | |
FluorSave Reagent | Merck | 345789 | |
Ultrasonic bath | Bandelin electronic | Type: RK 100 SH |