preparação e<em> In Vitro</em> Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

Summary

Este manuscrito descreve a entrega eficiente, não-viral de miR a células endoteliais por um vector de PEI / MNP e a sua magnetização. Assim, em adição à modificação genética, esta abordagem permite a orientação celular magnética e ressonância magnética detectabilidade. A técnica pode ser usada para melhorar as características de produtos de células terapêuticas.

Abstract

Até à data, os tratamentos cirúrgicos e farmacológicos disponíveis para doenças cardiovasculares (DCV) são limitados e frequentemente paliativo. Ao mesmo tempo, e de genes de células terapêuticas são abordagens alternativas altamente promissores para o tratamento de doenças cardiovasculares. No entanto, a vasta aplicação clínica da terapia genética é muito limitado pela falta de sistemas de distribuição de genes adequados. O desenvolvimento de vectores de entrega de genes adequados podem fornecer uma solução para os desafios actuais em terapia celular. Em particular, os inconvenientes existentes, tais como a eficiência limitada e retenção celular baixo no órgão lesionado, pode ser superado por engenharia celular apropriada (isto é, genética) antes do transplante. O protocolo apresentado descreve a modificação transiente eficiente e segura de células endoteliais utilizando uma nanopartícula magnética superparamagnético polietilenoimina (PEI / MNP) -based vector de entrega. Além disso, o algoritmo e métodos para a caracterização de células são definidas. O intracellu sucessoentrega lar de microARN (MIR) em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foi alcançado sem afectar a viabilidade celular, a funcionalidade, ou comunicação intercelular. Além disso, esta abordagem foi comprovada a causar um efeito funcional forte em exógeno introduzido miR. Importante, a aplicação deste vector baseia-MNP assegura magnetização célula, com acompanhamento de possibilidades de direccionamento magnético e não-invasiva rastreio MRI. Isto pode fornecer uma base para magneticamente guiados terapêutica de células geneticamente modificadas, que podem ser monitorados de forma não invasiva com a RM.

Introduction

Terapia genética e celular são ferramentas poderosas que têm o potencial para resolver os desafios atuais no tratamento de doenças cardiovasculares. Apesar do fato de que ambas as abordagens estão sendo testadas em ensaios clínicos, eles ainda não estão prontos para a ampla aplicação clínica ^1. Notavelmente, uma abordagem comum para enfrentar os desafios de terapia genética e celular é desenvolver vectores de entrega de genes multifuncionais adequadas para aplicação clínica. A falta de sistemas de entrega de genes seguros e eficazes é a preocupação principal da terapia génica. Ao mesmo tempo, a engenharia genética de produtos celulares antes do transplante poderia superar os graves problemas de terapia celular, tais como a baixa eficiência (transplante de células pós-tronco, por exemplo, no campo cardíaca, apenas ~ 5% de melhoria funcional é conseguido ^um ) e a fraca retenção / enxerto no local da lesão (isto é, a retenção de célula cai abaixo de 5-10% dentro de minutos a horas por-aplicação, independentemente da via de administração ^{2, 3, 4).}

Até à data, os vectores virais exceder grandemente os sistemas n virais em termos de eficácia, o que resultou na sua mais ampla aplicação em ensaios clínicos (~ 67%) ^5. No entanto, os veículos virais trazem riscos sérios, tais como a imunogenicidade (e a subsequente resposta inflamatória, com complicações graves), oncogenicidade, e limitações no tamanho do material genético transportado ^6. Devido a estas preocupações de segurança e os elevados custos de produo do vector viral, o uso de sistemas não-virais é preferível em certos casos, ^{7, 8.} É particularmente adequado para desordens que requerem correcção genética transiente, tal como a expressão de factores de crescimento controlam a angiogese (por exemplo, para o tratamento de doenças cardiovasculares) ou a DELIVEry de vacinas.

No nosso grupo, um sistema de entrega foi concebido por combinação de polietilenoimina ramificada 25-kDa (PEI) e nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (MNP) ligadas entre si por interacção biotina-estreptavidina ^9. Este vector é uma potencial ferramenta para a engenharia genética de células, permitindo a sua magnetização simultânea antes do transplante. Este último proporciona uma base para a orientação magnética / retenção, o que é particularmente promissora hoje em dia, como técnicas de segmentação magnéticas avançadas estão a ser desenvolvidas com êxito ^10. Além disso, as células magneticamente responsivas resultantes têm o potencial de ser de forma não invasiva monitorizada por imagiologia por ressonância magnética (MRI) ou imagiologia de partículas magnéticas ^{11, 12.}

No caso do vector de PEI / MNP, poliamina assegura condensação de ácido nucleico e, assim, a protecção do factor degradantes s, internalização vector em células, e endossomal escapar ^5. O MNPs complementar as propriedades de PEI, não só em termos de orientação magnética, mas também pela redução da toxicidade conhecida PEI ^{7, 13, 14.} Anteriormente, as propriedades vector PEI / MNP foram ajustadas em termos de eficiência de transferência (isto é, ADNp e miARN) e segurança usando fibroblastos mesenquimais humanas e células estaminais ^{15, 16.}

Neste texto, um protocolo detalhado no pedido de PEI / MNPs para a geração de células modificada-miARN é descrito ^17. Para este fim, HUVECs são utilizados e representam um modelo estabelecido para a angiogênese in vitro. Eles são difíceis de transfectar e são susceptíveis a influência tóxico ^{18, 19,}ass = "xref"> 20. Além disso, nós fornecemos um algoritmo para avaliar tais células in vitro, incluindo a sua segmentação, a comunicação intercelular, e detecção de ressonância magnética.

Protocol

Cordões umbilicais humanos para isolamento de células foram obtidas pós-parto de informadas as mulheres saudáveis que deram o seu consentimento por escrito para o uso deste material para pesquisa de acordo com a Declaração de Helsinki. O comitê de ética da Universidade de Rostock aprovou o estudo apresentado (reg. Não. A 2011 06, prolongada 23 de setembro de 2013). 1. Preparação de Complexos de transfecção A biotinilação de polietilenoimina (PEI). …

Representative Results

O principal objectivo do protocolo proposto é produzir células miR-modificados magneticamente responsivas e para realizar a sua caracterização exacta (Figura 1). Como resultado, as células transfectadas de forma eficiente, que respondem à selecção e orientação magnética e detectáveis ​​com MRI, deve ser obtida. Em primeiro lugar, as identidades de HUVECs isolados foram confirmadas por coloraç?…

Discussion

A produção de células geneticamente modificadas carregados com nanopartículas superparamagnéticas para a sua orientação mais magneticamente controlada é apresentado no protocolo corrente. A aplicação bem sucedida desta estratégia permite a resolução de algumas dificuldades de terapia celular, como uma baixa retenção e pobre enxerto no local da lesão ^{2, 3, 4,} através do fornecimento de um produto celular segment…

Materials

PEI 25 kDa	Sigma Aldrich	408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17085101	Containing Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Reagent solution 2%	Sigma Aldrich	7285
Glycine	Sigma Aldrich	410225
Pierce Biotin Quantitation Kit	Thermo Scientific	28005
Microplate reader Model 680	Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles	Promega	Z5481
Millex-HV PVDF Filter	Merck	SLHV013SL	0.45µm
Libra 120 transmission electron microscope	Zeiss		Acceleration Voltage 120KV
Sapphire X-ray detector	EDAX-Amatek
Cell culture plastic	TPP
NHS-Esther Atto 565	ATTO-TEC GmbH	AD 565-31
NHS-Esther Atto 488	ATTO-TEC GmbH	AD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kit	Mirus Bio	MIR 9650
Biotin Atto 565	ATTO-TEC GmbH	AD 565-71
Collagense Type IV Gibco	Thermo Scientific	17104019
Endothelial growth medium, EGM-2	Lonza	CC-3156 & CC-4176
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	15140122	100 U/ml, 100µg/ml
Matrigel	BD Biosciences	356234
anti-PECAM-1 antibody	Santa Cruz	sc-1506
MS MACS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit	Thermo Scientific	L10119
Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control	Thermo Scientific	AM17120	"Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript
Pre-miR miRNA Precursor Molecules – Negative Control	Thermo Scientific	AM17110	"scr-miR" in the manuscript
Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor	Thermo Scientific	AM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 system	Zeiss
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127	4% solution in PBS
DAPI nuclear stain	Thermo Scientific	D1306
NucleoSpin RNA isolation Kit	Machery-Nagel	740955
mirVana miRNA Isolation Kit	Thermo Scientific	AM1560
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Thermo Scientific	4366596
StepOnePlus Real-Time PCR System	Applied Biosystems
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Scientific	4368814
hsa-miR-92a TaqMan assay	Thermo Scientific	000431	Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready Mix	Nippon Genetics	LS27
ITGA5 TaqMan assay	Thermo Scientific	Hs01547673_m1
RNU6B TaqMan assay	Thermo Scientific	001093
18S rRNA Endogenous Control	Thermo Scientific	4333760F
Gelatin	Sigma Aldrich	G7041
CellTrace Calcein Red-Orange	Thermo Scientific	C34851
PBS	Pan Biotech	P04-53500
BSA	Sigma Aldrich
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
7.1 Tesla animal MRI system	Bruker Corporation	A7906
ImageJ software	National Institutes of Health		upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS device	Bruker Biospin
Matlab software	Mathworks
Ring Neodym Magnet	magnets4you GmbH	RM-10x04x05-G	ø 10 mm; remanescence is ~1.3T, coercivity ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit	Thermo Scientific	C10340
FluorSave Reagent	Merck	345789
Ultrasonic bath	Bandelin electronic	Type: RK 100 SH