We beschrijven het gebruik van een fenotypische fluorescentie-gebaseerde neuraminidase remming test om de gevoeligheid van influenza A en B virussen beoordelen in de neuraminidase-remmer klasse van antivirale middelen.
De neuraminidase (NA) remmers zijn de enige klasse van antivirale middelen goedgekeurd voor de behandeling en preventie van influenza die effectief zijn tegen momenteel circulerende stammen zijn. In aanvulling op het gebruik ervan bij de behandeling van seizoensgebonden influenza, hebben de NA-remmers zijn opgeslagen door een aantal landen voor gebruik in het geval van een pandemie. Het is daarom belangrijk om de gevoeligheid van circulerende influenzavirussen om deze klasse van antivirale middelen te controleren. Er zijn verschillende assays die kunnen worden gebruikt om de gevoeligheid van influenzavirussen de NA inhibitors te beoordelen, maar het enzym remmingstesten met behulp van een fluorescent substraat of een chemiluminescerend substraat zijn de meest gebruikte en aanbevolen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een op fluorescentie gebaseerde assay influenzavirus gevoeligheid beoordelen NA remmers. De assay is gebaseerd op het NA-enzym splitsing van de 2 '- (4-methylumbelliferyl-) -α-D-N -acetylneuraminic acid (Muñana) Substraat naar het fluorescente product 4-methylumbelliferon (4-MU) vrijgeven. Derhalve wordt het remmende effect van een NA-remmer op het influenzavirus NA bepaald op basis van de concentratie van het NA remmer die vereist is om 50% vermindering van de activiteit NA, gegeven als een IC50-waarde.
Hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) zijn de twee belangrijkste oppervlakte glycoproteïnen van influenza A en B virussen. HA bindt aan de siaalzuur-galactose van celoppervlak glycoproteïnen of glycolipiden, terwijl de NA vrijgeeft virus door splitsing van de siaalzuur van galactose aan het celoppervlak 1. De NA-remmers zijn een klasse van influenza antivirale middelen die rationeel ontworpen om strak te binden aan de NA enzymatisch actieve plaats, waardoor de introductie en verspreiding van het virus nageslacht voorkomen. Oseltamivir en zanamivir zijn twee NA-remmers die in veel landen zijn erkend wereldwijd voor de behandeling en preventie van influenza. In de afgelopen jaren, twee extra NA-remmers, peramivir en laninamivir, zijn goedgekeurd voor gebruik in een beperkt aantal landen. Screening van influenzavirussen op gevoeligheid voor remmers NA en de identificatie van mutaties die resistentie zijn belangrijk bij het bepalen en bewaken van de effectiveness van deze klasse van antivirale middelen.
In de laatste 16 jaar is de fluorescentie gebaseerde NA remmingstest routinematig uitgevoerd bij de WHO Samenwerkingscentrum voor onderzoekscollectie Influenza, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) aan de veranderende trend antivirale gevoeligheid bij circulerende influenzavirussen controleren. Jaarlijks worden meer dan 2.000 influenzavirussen getest op antivirale gevoeligheid. In de meeste seizoenen influenza,> 98% van de virussen zijn gevoelig voor alle vier de NA-remmers 2, 3, 4, hoewel tijdens de 2007-2008 noordelijk halfrond influenza seizoen, is er een sterke stijging van het aantal voormalige seizoensgebonden A (H1N1) virussen was dat de gevoeligheid was gereduceerd tot oseltamivir 5. Deze groep van virussen, die de NA aminozuursubstitutie H275Y bevatte, verspreid naar de rest van de wereld aan het einde van 2008, waarmee oseltamivir inappropriaten wereldwijd voor de behandeling van dit virus. De overgrote meerderheid van momenteel circulerende influenza B, influenza A (H3N2) en influenza A (H1N1) pdm09 stammen gevoelig voor oseltamivir, maar door clusters van A (H1N1) pdm09 varianten die het NA aminozuursubstitutie H275Y dat het karakter verminderde oseltamivir en peramivir gevoeligheid, zijn gemeld in verschillende delen van de wereld 6, 7.
Vanwege de noodzaak van een voldoende hoge titer virus moeten klinische monsters (met inbegrip van dierlijke nasale wassingen) worden doorgekweekt in zowel celkweek of bevruchte kippeneieren vóór antivirale gevoeligheidstests. De NA remmingstest beschreven in dit artikel kan worden onderverdeeld in drie delen:
Bepalen van het lineaire bereik voor het fluorescent product 4-methylumbelliferon (4-MU) op een bepaalde fluorometer
Vanwege de inherente verschillen tussen fluorometers, tHij lineaire bereik voor het fluorescerende eindproduct, 4-MU, en de relatieve fluorescentie-eenheid (RFU), te worden vastgesteld. Zodra het lineaire bereik van 4-MU wordt gebracht, wordt de optimale doelsignaal geselecteerd, waarop de concentratie van de influenzavirussen wordt aangepast in de NA activiteitstest. Eenmaal voltooid voor een bepaald fluorometer, dient deze niet te worden herhaald.
Het bepalen van de NA activiteit van de virussen
De NA activiteitstest is een eenvoudige test die de toevoeging van de 2 'omvat – (4-methylumbelliferyl-) -α-D-N -acetylneuraminic acid (Muñana) substraat serieel verdunde virus. De hoeveelheid fluorescerende eindproduct 4-MU gevormd door de splitsing van Muñana door het NA wordt gemeten met een fluorometer. De geschikte virusverdunning gebruiken in het NA-remmingstest wordt geselecteerd door het uitzetten van fluorescentie-eenheden tegen virusverdunning. Van de sigmoïdale curve geproduceerd, dient het middelpunt van het lineaire gedeelte overeen methet 4-MU lineaire bereik van de fluorometer bepaald deel 1 en de geschikte concentratie van virussen in kennis worden in deel 3.
Het beoordelen virus gevoeligheid voor remmers met NA NA remmingstest
Om de gevoeligheid van virussen een bepaalde NA remmer beoordelen, zijn virussen in het verdunning bepaald in punt 2 geïncubeerd met een reeks NA remmerconcentraties. Na een verdere incubatie met Munana, wordt de 4-MU gevormd door ongeremde virussen gemeten in RFU door de fluorometer. Het remmende effect van de remmer op de NA NA enzymactiviteit van een virus wordt berekend volgens de NA remmerconcentratie nodig te verminderen 50% van het NA-activiteit, gegeven als een IC50-waarde.
De wereldwijde monitoring influenzavirus NA gevoeligheid voor remmers wordt momenteel uitgevoerd door een aantal laboratoria met behulp van fluorescente of chemiluminescente NA remmingstesten 11, 12. De fluorescentie wordt vaker gebruikt dan de chemiluminescente assay. Hoewel beide assays robuust en reproduceerbaar, de IC50-waarden verkregen uit de op fluorescentie gebaseerde assay zijn vaak hoger dan de chemiluminescentie gebaseerde test, die een directe vergelijking van de gegevens van de twee assays moeilijke 13. Zelfs met het gebruik van hetzelfde protocol, kunnen gegevens gegenereerd door één laboratorium verschillen van elkaar. Vanwege deze verschillen tussen laboratoria, de WHO Werkgroep Surveillance van influenzavaccins gevoeligheid produceerde een leidraad om te helpen bij vergelijkingen tussen laboratoria. In plaats van het vergelijken van de absolute IC 50-waarden, deze richtlijn gebruiksa vergelijking op basis van het IC 50-voudig verschil voor de gemiddelde IC50 van het NI influenzavirussen getest in elk afzonderlijk laboratorium. De mogelijkheid om gegevens van de vijf samenwerkende centra vergelijken heeft geresulteerd in de jaarlijkse publicatie van globale influenzavaccins gevoeligheidsgegevens 2, 3, 4. De beschikbaarheid van de grote hoeveelheid influenza gevoeligheid gegevens in het publieke domein stelt onderzoekers in staat om 50 gegevens te vergelijken IC van die studies met die gegenereerd in hun eigen laboratoria.
Andere NA remming testen die een gelijkaardig concept vast te stellen zijn ook commercieel verkrijgbaar. Deze commerciële kits die kant-en-klare reagentia bevatten (NA remmers niet inbegrepen) even reproduceerbaar. De interne NA remmingstest is aanzienlijk goedkoper dan de commerciële kits, omdat de meerderheid van de reagentia intern kunnen worden gemaaktgrotere hoeveelheden en de Munana substraat, die eerder de belangrijkste kosten van de test bestaat, kan nu worden gekocht bij verschillende bronnen tegen concurrerende prijzen. De kosten van het testen van een influenza-isolaat per geneesmiddel ongeveer $ 1 (USD). Op de Melbourne WHOCCRRI zijn verbeteringen aangebracht in de interne NA remmingsassay na oprichting van een robotplatform voor de vloeistofverwerking componenten van het assay. Naast de handmatige bereiding van virusverdunningen, de meeste procedures worden uitgevoerd met de vloeistofverwerking robot. Niet alleen is dit een minimum te beperken manueel hanteren, maar het verhoogt ook het aantal tests die kan worden uitgevoerd in een dag.
Hoewel de NA remmingstest stevig en solide zijn er een aantal kritische stappen die moeten worden aangevuld met extra zorg. Eerst, onregelmatigheid van de NA remmerconcentraties kan de inhibitie curven en de IC50 waarden verplaatsen; Daarom moet nadrukkelijk aandacht worden besteedbetaald bij het bereiden van de NA remmerconcentraties. Ten tweede, nauwkeurig pipetteren en precieze incubatieperioden zijn van cruciaal belang voor het behoud van consistente resultaten assays; Dit kan worden bereikt door gekalibreerde pipetten en timers. De opname van controle virussen in elke test maakt ook de monitoring van de test prestaties van de test om te testen en gedurende lange perioden van tijd. Ten derde, omdat de NA enzymactiviteit van seizoensgebonden influenzavirussen optimaal is bij pH 6,5, de juiste pH van de assaybuffer belangrijk. Sommige rapporten hebben gevonden dat het gebruik van lagere pH-omstandigheden kan verbetert de identificatie van influenza varianten, zoals de A (H7N9) variant bevattende de mutatie R292K 14, 15. Echter de wijziging van de pH van de assaybuffer verschuiven de IC50 waarden, en kan de vergelijking van gegevens bemoeilijken in laboratoria en tussen laboratoria. Andere modificaties en probleemoplossing p kan wordenerformed worden in tabel 5.
De NA-remmers zijn de enige klasse van goedgekeurde antivirale middelen die op dit moment werkzaam zijn tegen circulerende griepvirussen. Tot andere antivirale klassen beschikbaar zijn voor klinisch gebruik, zal de antivirale gevoeligheid bewaking van circulerende influenzavirussen zijn gericht op NA-remmers alleen. Vanwege de eenvoud en de reproduceerbaarheid van de resultaten, het gebruik van het NA remmingstest met influenzavirus NA gevoeligheid voor remmers beoordelen blijft.
The authors have nothing to disclose.
De Melbourne WHO Collaborating Centre for Reference en onderzoek inzake het Influenza wordt ondersteund door de Australische regering Department of Health.
Influenza A and B viruses | Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs | ||
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | PTA-6500 | |
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Biosynth AG | M-5507 | |
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Sigma | M8639 | |
4-Methylumbelliferone (4-MU) | Sigma | M1381-25G | |
2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid) | Sigma | M8250-250G | |
Calcium Chloride (Ca Cl2) | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution) | Thermo Fisher Scientific | PIE28324 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | APS AJAX Finechem | 482-2.5KG | |
Absolute Ethanol | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
96-well clear flat-bottom plates | NUNC | 456537 | |
96-well U-bottom plates | Greiner Bio-one | 4650101 | |
8 channel deep well block | Pacific Laboratory Products | RES-MW8-HP | |
96-well deep plates, 2.0mL square wells | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
Plate sealers | Thermo Fisher Scientific | 236366 | |
Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
Single-channel pipettes (1 µL – 1000 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
Multi-channel pipettes | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 – 1250 µL volume) | |
Pipette tips (1 µL – 1250 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) | Greiner Bio-one | P7740-200EA and P7865-200EA | |
Pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | |
Centrifuge tubes 50 mL | BD Bioscience | 352070 | |
Racked tubes | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm | TermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
Ascent software | TermoFisher Scientific | 5185410CD | |
Incubator set at 37°C | Lab Supply | Biocell 1000 | |
Zanamivir | GlaxoSmithKline | Request directly from the company | |
Oseltamivir carboxylate | Roche | ||
Peramivir (BCX-1812) | BioCryst | ||
Laninamivir (R-125489) | Daiichi-Sankyo | ||
JASPR v1.2 | Influenza Division at the CDC Atlanta, USA | freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov) |