Мы опишем использование фенотипической флуоресценции на основе ингибирования нейраминидазы анализа для оценки восприимчивости вирусов гриппа А и В к классу ингибиторов нейраминидазы противовирусных препаратов.
Ингибиторы (NA) нейраминидазы являются единственным классом противовирусных препаратов, одобренных для лечения и профилактики гриппа, которые в настоящее время эффективны против циркулирующих штаммов. В дополнении к их использованию в лечении сезонного гриппа, ингибиторы NA были складированы рядом стран для использования в случае возникновения пандемии. Поэтому важно следить за восприимчивостью циркулирующих вирусов гриппа к этому классу противовирусных препаратов. Существуют различные типы анализов, которые могут быть использованы для оценки восприимчивости вирусов гриппа к ингибиторам NA, но ингибирование фермента анализы с использованием либо флуоресцентного субстрата или хемилюминесцентный субстрат являются наиболее широко используется и рекомендуется. Этот протокол описывает использование флуоресцентного анализа на основе для оценки восприимчивости вируса гриппа к ингибиторам NA. Анализ основан на ферменте NA расщепление 2 '- (4-метилумбеллиферил) -α-D Н -acetylneuraminic кислота (Muñana) Субстрат для высвобождения флуоресцентного продукта 4-метилумбеллиферона (4-MU). Таким образом, ингибирующее действие ингибитора Ан На на NA вируса гриппа определяется на основе концентрации ингибитора NA, которое требуется , чтобы уменьшить 50% от активности НС, данного в качестве значения IC 50.
Гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) являются двумя основными поверхностными гликопротеинами вирусов гриппа А и В. HA связывается с сиаловой кислотой-галактозой клеточных поверхностных гликопротеинов или гликолипидов, в то время как НС выпускает вирус расщепления сиаловых кислот из галактозы на клеточной поверхности 1. Ингибиторы NA представляют собой класс противовирусного гриппа, которые были рационально предназначены для плотно связываются с активным сайтом ферментного Н.А., тем самым предотвращая высвобождение и распространение вируса потомства. Профилактический и занамивир два ингибитора NA, которые были одобрены во многих странах мира для лечения и профилактики гриппа. В последние годы, два дополнительных ингибиторов NA, перамивир и laninamivir, были одобрены для использования в ограниченном числе стран. Скрининг вирусов гриппа на чувствительность к ингибиторам NA и идентификации мутаций, которые придают устойчивость играют важную роль в определении и мониторинге effectiveness этого класса противовирусных.
В течение последних 16 лет, флуоресценция на основе Н.А. анализ ингибирования была выполнена обычно в Сотрудничающий центр ВОЗ по контролю и исследованиям гриппа, Мельбурн (Мельбурн WHOCCRRI) наблюдение за изменением тенденции противовирусной чувствительности среди циркулирующих вирусов гриппа. Ежегодно более 2000 вирусов гриппа тестируют на чувствительность к противовирусным препаратам. В большинстве сезонов гриппа,> 98% вирусов восприимчивы ко всем четырем ингибиторов NA 2, 3, 4, хотя во время сезона гриппа 2007-2008 годов, был всплеск числа бывших сезонных A (H1N1) вирусов что уменьшило восприимчивость к озельтамивиру 5. Эта группа вирусов, которые содержали NA заместительной аминокислоты H275Y, распространился на остальную часть мира к концу 2008 года, что делает осельтамивир inappropriел глобально для лечения этого вируса. Подавляющее большинство циркулирующих в настоящее время гриппа B, гриппа A (H3N2) и гриппа A (H1N1) штаммы pdm09 восприимчивы к осельтамивиру, хотя общественные кластеры A (H1N1) вариантов pdm09, содержащих аминокислотную замену H275Y НС, что придает уменьшенную оселтамивира и перамивир восприимчивость, были зарегистрированы в различных частях мира , 6, 7.
Из-за необходимость достаточно высокого титр вируса, клинические образцы (в том числе животных назальных смывов) должны быть пассировать в любой культуре клеток или куриные эмбрионы до начала противовирусной тестировании чувствительности. Анализ ингибирования НСА описан в этой статье, можно разделить на три секции:
Определение линейного диапазона для флуоресцентного продукта 4-метилумбеллиферона (4-MU) на конкретном флуорометре
Из-за присущие различия между флюорометрами, тон линейный диапазон для флуоресцентного конечного продукта, 4-MU, и относительная флуоресценция блока (РФС), должен быть установлен. После того, как линейный диапазон для 4-MU установлен, выбран оптимальный целевой сигнал, к которому концентрация вирусов гриппа регулируется в анализе активности НСА. После завершения для конкретного флуорометре, это не должно быть повторено.
Определение активности NA вирусов
Анализ активности Н.А. представляет собой простой тест , который включает в себя добавление 2 '- (4-метилумбеллиферил) -α-D Н -acetylneuraminic кислоты (Muñana) субстрата серийно разводили вирусы. Количество флуоресцентного конечного продукта 4-MU генерируется из расщепления Muñana по НС измеряется с помощью флуориметра. Соответствующее разведение вируса, чтобы использовать в анализе ингибирования NA выбрано путем построения флуоресценции единиц против вируса разбавления. Из сигмовидной кривой производства, средняя точка линейного участка должна соответствовать4-МУ линейного диапазон флуорометра определяется в разделе 1, и информирует соответствующую концентрацию вирусов, которые будут использоваться в разделе 3.
Оценка чувствительности вируса к ингибиторам NA с помощью анализа ингибирования NA
Для оценки восприимчивости к вирусам конкретного ингибитора NA, вирусы при разбавлении, определенной в разделе 2, инкубируют с диапазоном концентраций ингибитора NA. После последующей инкубации с Muñana, 4-MU генерируется неингибированными вирусы измеряются в РФСЕ по флуорометру. Ингибирующее действие ингибитора НСА по ферментативной активности NA вируса рассчитываются в соответствии с концентрацией ингибитора NA , необходимой для снижения на 50% активности НСА, данной в качестве значения IC 50.
Глобальный мониторинг вирус гриппа восприимчивость к ингибиторам NA в настоящее время проводится рядом лабораторий с использованием либо флуоресцентные или хемилюминесцентным ингибирования Н.А. анализов 11, 12. Флуоресцентный анализ чаще используются, чем хемилюминесцентный анализ. Хотя оба анализы надежные и воспроизводимые, значение IC 50 , полученное из флуоресцентного анализа на основе часто выше , чем в анализе на основе хемилюминесценции, что делает прямое сравнение данных из двух анализов сложных 13. Даже при использовании одного и того же протокола, данные, полученные из одной лаборатории, может варьироваться в зависимости от другого. Из-за этих различий между лабораториями, Рабочая группа ВОЗ по надзору за гриппом противовирусной Восприимчивость подготовила руководство для оказания помощи в межлабораторных сравнений. Вместо того , чтобы сравнивать абсолютные значения IC 50, эта директива использованияСравнение са на основе кратной разницы IC 50 к медиане IC 50 из вирусов гриппа NI испытанных в каждой конкретной лаборатории. Возможность сравнения данных из пяти сотрудничающих центров привела к ежегодной публикации глобального гриппа противовирусные данных восприимчивости 2, 3, 4. Наличие большого количества данных , восприимчивость гриппа в общественном достоянии позволяет исследователям сравнивать IC 50 данных из этих исследований , с тем, что создается в своих собственных лабораториях.
Другие анализы ингибирования NA, которые принимают подобную концепцию также коммерчески доступны. Эти коммерческие наборы, которые содержат готовые к использованию реагентов (ингибиторы НС не включен) в равной степени воспроизводимы. Тем не менее, в доме Н. А. Анализ ингибирования существенно дешевле, чем коммерческие наборы, потому что большинство реагентов может быть сделано в доме вбольшие количества и подложка Munana, которые ранее составляли основную стоимость анализа, теперь можно приобрести из различных источников по конкурентоспособным ценам. Стоимость тестирования одного изолят гриппа на лекарства составляет около $ 1 (USD). В Melbourne WHOCCRRI, улучшения были сделаны к НСУ ингибированию в доме после включения роботизированной платформы для обработки жидких компонентов анализа. Помимо ручного приготовления вирусных разведений, большинство процедур выполняются с использованием жидкостной обработки робота. Это не только свести к минимуму ручной обработки, но также увеличивает количество анализов, которые могут быть запущены в день.
Хотя ингибирование анализ НСА является весьма надежным, существует целый ряд критических шагов, которые должны быть выполнено с дополнительной помощью. Во- первыхи, какие – либо нарушения в концентрации ингибитора NA может сместить кривые ингибирование и значение IC 50; Поэтому, особое внимание должно бытьзаплатил при подготовке концентраций ингибитора NA. Во-вторых, точные пипетирующие и точные периоды инкубации имеют решающее значение для поддержания результатов различных анализов; это может быть достигнуто с помощью калиброванных пипеток и таймеры. Включение вирусов контроля в каждом анализе также позволяет контролировать производительность анализа от анализа к анализу и в течение длительных периодов времени. В-третьих, потому что активность фермента Н.А. вирусов сезонного гриппа является оптимальным при рН 6,5, правильный рН буфера для анализа имеет важное значение. Некоторые отчеты обнаружили , что использование более низких значениях рН может улучшает идентификацию вариантов гриппа, такие , как вариант А (H7N9) , содержащий мутацию R292K 14, 15. Тем не менее, модификации рН буфера для анализа сместится значения IC 50, и это может осложнить сравнение данных в лабораториях , так и между лабораторий. Другие модификации и поиска неисправностей, которые могут быть рerformed приведены в таблице 5.
Ингибиторы NA являются единственным классом утвержденного противовирусными, которые в настоящее время эффективны против циркулирующих вирусов гриппа. Пока другие противовирусные классы становятся доступными для клинического использования, чувствительность к противовирусным препаратам наблюдения циркулирующих вирусов гриппа будет сфокусировано на ингибиторы NA в одиночку. Из-за простоты и воспроизводимости результатов, использование анализа ингибирования для оценки NA вируса гриппа, восприимчивость к ингибиторам NA будет продолжаться.
The authors have nothing to disclose.
Мельбурн центр ВОЗ по контролю и исследованиям гриппа поддерживается Австралийским правительственным департаментом здравоохранения.
Influenza A and B viruses | Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs | ||
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | PTA-6500 | |
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Biosynth AG | M-5507 | |
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Sigma | M8639 | |
4-Methylumbelliferone (4-MU) | Sigma | M1381-25G | |
2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid) | Sigma | M8250-250G | |
Calcium Chloride (Ca Cl2) | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution) | Thermo Fisher Scientific | PIE28324 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | APS AJAX Finechem | 482-2.5KG | |
Absolute Ethanol | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
96-well clear flat-bottom plates | NUNC | 456537 | |
96-well U-bottom plates | Greiner Bio-one | 4650101 | |
8 channel deep well block | Pacific Laboratory Products | RES-MW8-HP | |
96-well deep plates, 2.0mL square wells | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
Plate sealers | Thermo Fisher Scientific | 236366 | |
Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
Single-channel pipettes (1 µL – 1000 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
Multi-channel pipettes | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 – 1250 µL volume) | |
Pipette tips (1 µL – 1250 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) | Greiner Bio-one | P7740-200EA and P7865-200EA | |
Pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | |
Centrifuge tubes 50 mL | BD Bioscience | 352070 | |
Racked tubes | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm | TermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
Ascent software | TermoFisher Scientific | 5185410CD | |
Incubator set at 37°C | Lab Supply | Biocell 1000 | |
Zanamivir | GlaxoSmithKline | Request directly from the company | |
Oseltamivir carboxylate | Roche | ||
Peramivir (BCX-1812) | BioCryst | ||
Laninamivir (R-125489) | Daiichi-Sankyo | ||
JASPR v1.2 | Influenza Division at the CDC Atlanta, USA | freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov) |