Vi beskriver användningen av en fenotypisk fluorescensbaserad neuraminidas inhibitionsanalys för att bedöma känsligheten hos influensa A och B-virus till neuraminidashämmaren klass av antivirala läkemedel.
De neuraminidas (NA) inhibitorer är den enda klass av antivirala läkemedel som godkänts för behandling och profylax av influensa som är effektiva mot aktuella cirkulerande stammar. Förutom deras användning vid behandling av säsongsbunden influensa, har NA-hämmare lagring av ett antal länder för användning i händelse av en pandemi. Det är därför viktigt att följa känsligheten hos cirkulerande influensavirus till denna klass av antivirala läkemedel. Det finns olika typer av analyser som kan användas för att bedöma mottagligheten hos influensavirus till NA-inhibitorer, men de enzymhämningsanalyser med användning av antingen ett fluorescerande substrat eller en kemiluminiscent substrat är den mest använda och rekommenderade. Detta protokoll beskriver användningen av en fluorescens-baserad analys för att utvärdera influensavirus mottaglighet för NA-hämmare. Analysen är baserad på NA enzymet klyver 2 '- (4-metylumbelliferyl) -α-D- N -acetylneuraminic syra (Munana) Substratet för att frisätta den fluorescenta produkten 4-metylumbelliferon (4-MU). Därför är den inhiberande effekten av an NA-inhibitor på influensavirus NA bestämmas baserat på koncentrationen av NA inhibitor som krävs för att reducera 50% av NA-aktivitet, som ges som ett IC50-värde.
Hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) är de två stora ytglykoproteiner av influensa A och B-virus. HA binder till sialinsyra-galaktos av glykoproteiner eller glykolipider på cellytan, medan NA frisätter viruset genom klyvning av sialinsyra från galaktos på cellytan en. NA-hämmare är en klass av influensa antivirala medel som var rationellt utformade för att binda hårt till NA enzymatiska aktiva stället, för att därigenom förhindra frisättningen och spridning av virus avkomma. Oseltamivir och zanamivir är två NA-hämmare som har godkänts i många länder över hela världen för behandling och profylax av influensa. Under de senaste åren, ytterligare två NA-hämmare, peramivir och laninamivir, varit har godkänts för användning i ett begränsat antal länder. Screening av influensavirus för mottaglighet för NA-hämmare och identifiering av mutationer som ger resistens är viktiga för att bestämma och övervaka effectiveness av denna klass av antivirala läkemedel.
Under de senaste 16 åren har fluorescens-baserade NA hämningsanalys utförts rutinmässigt vid WHO Collaborating Centre for referens och forskning om influensa, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) för att övervaka den förändrade trenden av antiviral känslighet bland cirkulerande influensavirus. Årligen är mer än 2.000 influensavirus testas för antiviral känslighet. I de flesta influensa säsonger,> 98% av virus är känsliga för alla fyra NA inhibitorer 2, 3, 4, även om under 2007-2008 norra halvklotet influensasäsongen, fanns det en ökning i antalet av tidigare säsongs A (H1N1) virus som hade minskad känslighet för oseltamivir 5. Denna grupp av virus, som innehöll NA aminosyrasubstitution H275Y, spridas till resten av världen i slutet av 2008, vilket gör oseltamivir inappropriåt globalt för behandling av detta virus. Den stora majoriteten av närvarande cirkulerande influensa B, influensa A (H3N2) och influensa A (H1N1) pdm09 stammar är känsliga för oseltamivir, även om gemenskap kluster av A (H1N1) pdm09 varianter innehållande NA aminosyrasubstitutionen H275Y som ger reducerad oseltamivir och peramivir känslighet har rapporterats i olika delar av världen 6, 7.
På grund av behovet av en tillräckligt hög virustiter, måste kliniska prover (inklusive djur nasala tvättar) att passera i endera cellkultur eller embryonerade hönsägg före antiviral resistensbestämning. NA-inhiberingsanalys beskrivs i denna artikel kan delas in i tre sektioner:
Bestämning av den linjära området för den fluorescerande produkten 4-metylumbelliferon (4-MU) på en viss fluorometer
På grund av de inneboende skillnader mellan fluorometrar, than linjärt område för den fluorescerande slutprodukten, 4-MU, och den relativa fluorescensenhet (RFU), måste fastställas. När det linjära området för 4-MU är etablerad, är den optimala målsignalen vald, till vilken koncentrationen av influensavirus justeras i NA-aktivitetsanalys. När de är färdiga för en viss fluorometer, bör detta inte behöva upprepas.
Fastställande av NA aktiviteten av virus
NA aktivitetsanalysen är en enkel analys som innefattar tillsats av 2 '- (4-metylumbelliferyl) -α-D- N -acetylneuraminic syra (Munana) substrat för att serieutspäddes virus. Mängden fluorescerande slutprodukten 4-MU genereras från klyvning av Munana av NA mäts med användning av en fluorometer. Den lämpliga virusutspädning för användning i NA inhibitionsanalysen väljs genom plottning fluorescensenheter mot virusutspädning. Från sigmoidal kurva som produceras, bör mittpunkten av den linjära sektionen motsvararden 4-MU linjära området för fluorometern bestämd enligt punkt 1 och kommer att informera den lämpliga koncentrationen av virus som skall användas i avsnitt 3.
Bedöma virus mottaglighet för NA-inhibitorer med användning av NA-inhiberingsanalys
Att bedöma känsligheten av virus till en särskild NA-inhibitor, är virus vid utspädning bestämd enligt punkt 2 inkuberades med ett intervall av NA inhibitorkoncentrationer. Efter en efterföljande inkubation med Munana, är 4-MU genereras av ohämmade virus mätt i RFU genom fluorometern. Den inhiberande effekten av NA-hämmaren på NA-enzymaktiviteten hos ett virus beräknas enligt inhibitorkoncentration NA krävs för att reducera 50% av NA-aktivitet, som ges som ett IC50-värde.
Den globala övervakning av influensavirus mottaglighet för NA-inhibitorer är närvarande genomförs av ett antal laboratorier med användning av antingen fluorescerande eller kemiluminescerande NA inhibitionsanalyser 11, 12. Den fluorescerande analysen mer vanligt förekommande än den kemiluminiscenta analysen. Även om båda analyserna är robusta och reproducerbar, IC50-värden som erhållits från fluorescensbaserad analys är ofta högre än den kemiluminescens-baserad analys, vilket gör en direkt jämförelse av data från de två analyserna svåra 13. Även med användning av samma protokoll, kan data som genereras från ett laboratorium variera från en annan. På grund av dessa variationer mellan laboratorier, WHO arbetsgrupp för övervakning av influensa antivirala känslighet fram en riktlinje för att hjälpa till mellan laboratorier jämförelser. I stället för att jämföra de absoluta IC 50-värden, denna riktlinje användningsa jämförelse baserad på IC 50 faldig skillnad till median IC 50 av de influensavirus NI testade i varje enskilt laboratorium. Möjligheten att jämföra data från de fem samverkande centra har resulterat i den årliga publiceringen av global influensa antivirala mottaglighet uppgifter 2, 3, 4. Tillgängligheten av den stora mängden av influensa känslighetsuppgifter i det offentliga rummet tillåter forskare att jämföra IC50 data från dessa studier med det som genereras i sina egna laboratorier.
Andra NA hämningsanalyser som antar ett liknande koncept är också kommersiellt tillgängliga. Dessa kommersiella kit som innehåller färdiga att använda reagenser (NA-hämmare inte ingår) är lika reproducerbara. Emellertid är in-house NA inhibitionsanalys väsentligen billigare än de kommersiella kit, eftersom majoriteten av reagensen kan göras i-hus istörre kvantiteter och Muñana substratet, som tidigare består den huvudsakliga kostnaden för analysen, kan nu köpas från olika källor till konkurrenskraftiga priser. Kostnaden för att testa ett influensaisolat per drogen är ca $ 1 (USD). På Melbourne WHOCCRRI har förbättringar gjorts till in-house NA inhibitionsanalys efter införlivandet av en robotplattform för de flytande komponenterna hanterings av analysen. Bortsett från den manuella framställningen av virusspädningar, är majoriteten av de förfaranden som utförs med hjälp av vätskehanteringsrobot. Inte bara detta minimera manuell hantering, men det ökar också antalet analyser som kan köras på en dag.
Även NA inhibitionsanalysen är mycket robust, finns det ett antal viktiga steg som måste kompletteras med ytterligare vård. Först, varje oegentlighet vid inhibitorkoncentrationer NA kan skifta inhibitionskurvor och IC50-värdena; Därför bör uppmärksamhet varabetalas vid upprättandet inhibitorkoncentrationer NA. För det andra, exakt pipettering och exakt inkubationsperioder är avgörande för att upprätthålla konsekventa resultat över analyser; Detta kan uppnås genom att använda kalibrerade pipetter och timers. Införandet av kontrollvirus i varje analys möjliggör också övervakning av analysprestanda från analys till analys och över långa tidsperioder. Tredje, eftersom NA enzymaktiviteten hos säsongs influensavirus är optimal vid pH 6,5, är viktigt rätt pH i analysbuffert. Vissa rapporter har funnit att användningen av lägre pH-betingelser maj förbättrar identifiering av influensavarianter, såsom A (H7N9) -varianten som innehöll R292K mutationen 14, 15. Kommer emellertid modifiering av pH för analysbufferten skifta IC50-värdena, och detta kan komplicera jämförelsen av data inom laboratorier och mellan laboratorier. Andra modifieringar och felsökning som kan vara performed listas i tabell 5.
NA-hämmare är den enda klassen godkända antivirala medel som för närvarande effektiva mot cirkulerande influensavirus. Fram till andra antivirala klasser blir tillgängliga för klinisk användning, kommer den antivirala känsligheten övervakning av cirkulerande influensavirus fokuseras på NA-hämmare ensam. På grund av enkelheten och reproducerbarhet av resultat, användning av NA-inhiberingsanalys bedöma influensavirus mottaglighet för NA-hämmare kommer att fortsätta.
The authors have nothing to disclose.
The Melbourne WHO Collaborating Centre för referens och forskning om influensa stöds av den australiska regeringen Department of Health.
Influenza A and B viruses | Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs | ||
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | PTA-6500 | |
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Biosynth AG | M-5507 | |
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Sigma | M8639 | |
4-Methylumbelliferone (4-MU) | Sigma | M1381-25G | |
2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid) | Sigma | M8250-250G | |
Calcium Chloride (Ca Cl2) | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution) | Thermo Fisher Scientific | PIE28324 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | APS AJAX Finechem | 482-2.5KG | |
Absolute Ethanol | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
96-well clear flat-bottom plates | NUNC | 456537 | |
96-well U-bottom plates | Greiner Bio-one | 4650101 | |
8 channel deep well block | Pacific Laboratory Products | RES-MW8-HP | |
96-well deep plates, 2.0mL square wells | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
Plate sealers | Thermo Fisher Scientific | 236366 | |
Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
Single-channel pipettes (1 µL – 1000 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
Multi-channel pipettes | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 – 1250 µL volume) | |
Pipette tips (1 µL – 1250 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) | Greiner Bio-one | P7740-200EA and P7865-200EA | |
Pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | |
Centrifuge tubes 50 mL | BD Bioscience | 352070 | |
Racked tubes | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm | TermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
Ascent software | TermoFisher Scientific | 5185410CD | |
Incubator set at 37°C | Lab Supply | Biocell 1000 | |
Zanamivir | GlaxoSmithKline | Request directly from the company | |
Oseltamivir carboxylate | Roche | ||
Peramivir (BCX-1812) | BioCryst | ||
Laninamivir (R-125489) | Daiichi-Sankyo | ||
JASPR v1.2 | Influenza Division at the CDC Atlanta, USA | freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov) |