Vi beskriver anvendelsen af et fænotypisk fluorescensbaseret neuraminidase inhiberingsassay at vurdere følsomheden af influenza A og B virus til neuraminidaseinhibitoren klasse af antivirale lægemidler.
De (NA) inhibitorer neuraminidase er den eneste klasse af antivirale lægemidler er godkendt til behandling og forebyggelse af influenza, der er effektive over for tiden cirkulerende stammer. Ud over deres anvendelse i behandling af sæsoninfluenza, har NA-hæmmere blevet oplagret ved en række lande til brug i tilfælde af en pandemi. Det er derfor vigtigt at overvåge modtagelighed af cirkulerende influenzavira til denne klasse af antivirale midler. Der findes forskellige typer af assays, der kan anvendes til at vurdere modtagelighed af influenzavirus til NA-inhibitorer, men de enzymhæmning assays under anvendelse af enten et fluorescerende substrat eller et kemiluminescerende substrat er de mest udbredte og anbefales. Denne protokol beskriver anvendelsen af en fluorescens-baseret assay for at vurdere influenzavirus modtagelighed for NA-inhibitorer. Bestemmelsen er baseret på NA-enzymet spalte 2 '- (4-methylumbelliferyl) -α-D-N -acetylneuraminic syre (Muñana) Substrat for at frigive det fluorescerende produkt 4-methylumbelliferon (4-MU). Derfor er den inhiberende virkning af en NA-inhibitor på influenzavirus NA bestemmes baseret på koncentrationen af NA-inhibitor, der er nødvendig for at reducere 50% af NA-aktivitet, givet som en IC50-værdi.
Hæmagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) er de to store overfladeglycoproteiner af influenza A og B virus. HA binder til sialsyre-galactose celleoverfladeglycoproteiner eller glycolipider, mens NA frigiver virus ved at spalte sialinsyre fra galactose på celleoverfladen 1. NA-inhibitorer er en klasse af influenza antivirale stoffer, der blev rationelt udformede til at binde tæt til NA enzymatiske aktive sted, hvilket forhindrer frigivelse og spredning af virus afkom. Oseltamivir og zanamivir er to NA hæmmere, der er godkendt i mange lande verden over til behandling og forebyggelse af influenza. I de seneste år, to ekstra NA hæmmere, peramivir og laninamivir, er blevet godkendt til brug i et begrænset antal lande. Screening af influenzavirus for modtagelighed for NA-inhibitorer og identifikation af mutationer, der bibringer resistens er vigtige ved bestemmelse og overvågning af virkningsfuldeness af denne klasse af antivirale lægemidler.
I de sidste 16 år har fluorescens-baserede NA inhiberingsassay blevet udført rutinemæssigt på WHO samarbejdscenter for reference og Forskning vedrørende Influenza, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) for at overvåge skiftende tendens af antiviral følsomhed blandt cirkulerende influenzavira. Årligt bliver mere end 2.000 influenzavirus testet for antiviral modtagelighed. I de fleste influenzasæsoner,> 98% af vira er modtagelige for alle fire NA inhibitorer 2, 3, 4, selvom under 2007-2008 nordlige halvkugle influenzasæson, var der en stigning i antallet af tidligere sæsonmæssige A (H1N1) virus der havde reduceret modtagelighed over for oseltamivir 5. Denne gruppe af vira, som indeholdt NA aminosyresubstitution H275Y, spreder sig til resten af verden ved udgangen af 2008, hvilket gør oseltamivir inapproprispiste globalt til behandling af denne virus. Langt størstedelen af de aktuelt cirkulerende influenza B, influenza A (H3N2), og influenza A (H1N1) pdm09 stammer er modtagelige for oseltamivir, selvom community klynger af A (H1N1) pdm09 varianter indeholder NA aminosyresubstitution H275Y som giver reduceret oseltamivir og peramivir modtagelighed, er blevet rapporteret i forskellige dele af verden 6, 7.
På grund af behovet for en tilstrækkelig høj virustiter, skal kliniske prøver (herunder dyr næseskylninger) passeres i enten cellekultur eller befrugtede hønseæg før antiviral følsomhedstest. NA-inhiberingsassay beskrevet i denne artikel kan opdeles i tre sektioner:
Bestemmelse af den lineære område for det fluorescerende produkt 4-methylumbelliferon (4-MU) på et bestemt fluorometer
Grund af de iboende forskelle mellem fluorometre, than lineære område for det fluorescerende slutprodukt, 4-MU, og den relative fluorescens enhed (RFU), skal etableres. Når det lineære område for 4-MU er etableret, den optimale target signal valgt, at hvor koncentrationen af influenzavira justeres i NA-aktivitet assay. Når du er færdig til en bestemt fluorometer, bør dette ikke behøver at blive gentaget.
Bestemmelse af NA aktiviteten af virus
NA-aktivitetsanalyse en simpel analyse, der involverer tilsætning af 2 '- (4-methylumbelliferyl) -α-D-N -acetylneuraminic syre (Muñana) substrat til seriefortyndet vira. Mængden af fluorescerende slutprodukt 4-MU genereret fra spaltningen af Muñana af NA måles med et fluorometer. Den passende virusfortynding til brug i NA inhiberingsassay vælges ved at afbilde fluorescensenheder mod virus fortynding. Fra formet kurve, bør af midtpunktet af den lineære sektion svarer til4-MU lineære område fluorometer bestemt i punkt 1 og vil informere den passende koncentration af virus, der skal anvendes i afsnit 3.
Vurdere virus modtagelighed for NA inhibitorer under anvendelse af NA-inhiberingsassay
For at vurdere følsomheden af virus til en bestemt NA-inhibitor, er vira ved fortynding bestemt i punkt 2 inkuberet med en række NA inhibitorkoncentrationer. Efter en efterfølgende inkubation med Muñana omdannes 4-MU genereres af uhæmmede vira målt i RFU ved fluorometer. Den inhiberende virkning af NA inhibitoren på NA enzymaktiviteten af et virus er beregnet ifølge NA inhibitorkoncentration nødvendig for at reducere 50% af NA-aktivitet, givet som en IC50-værdi.
Den globale overvågning af influenzavirus modtagelighed for NA inhibitorer øjeblikket gennemføres af en række laboratorier under anvendelse af enten fluorescerende eller kemiluminiscerende NA inhiberingsassays 11, 12. Den fluorescenstest er mere almindeligt anvendt end den kemiluminescerende assay. Selvom begge assays er robuste og reproducerbare, IC50-værdierne opnået fra fluorescens-baseret assay er ofte højere end den chemiluminescens assay, hvilket gør en direkte sammenligning af dataene fra de to assays vanskelige 13. Selv med anvendelse af den samme protokol, kan data fra ét laboratorium variere fra en anden. På grund af disse forskelle mellem laboratorier, WHO arbejdsgruppe om overvågning af influenza Antiviral Følsomhed produceret en retningslinje for at hjælpe med sammenligninger mellem forskellige laboratorier. Snarere end at sammenligne de absolutte IC50-værdier, denne retningslinje brugsa sammenligning baseret på IC 50 ganges forskel midterplan IC50 for NI influenzavira testet i hvert enkelt laboratorium. Evnen til at sammenligne data fra de fem samarbejdende centre har resulteret i den årlige offentliggørelse af den globale influenza antivirale data om modtagelighed 2, 3, 4. Tilgængeligheden af den store mængde af influenza modtagelighed data i det offentlige rum giver forskerne at sammenligne IC50 data fra disse studier med der genererede i deres egne laboratorier.
Andre NA inhiberingsassays, der indfører et lignende koncept er også kommercielt tilgængelige. Disse kommercielle kits, der indeholder klar-til-brug-reagenser (NA inhibitorer ikke inkluderet) er lige reproducerbare. Imidlertid in-house NA inhiberingsassay er væsentligt billigere end de kommercielle kits, fordi størstedelen af de reagenser kan foretaget internt istørre mængder og Muñana substrat, som tidligere udgjorde den største omkostninger i analysen, kan nu købes fra forskellige kilder til konkurrencedygtige priser. Omkostningerne ved at teste en influenza isolat pr narkotika er ca $ 1 (USD). Ved Melbourne WHOCCRRI, er der sket forbedringer til den interne NA inhiberingsassay efter inkorporeringen af en robot platform for de flydende håndtering assayets komponenter. Bortset fra den manuelle fremstilling af virusfortyndingerne er størstedelen af de procedurer udført ved anvendelse af robot væskehåndteringsevne. Dette er ikke blot minimerer manuel håndtering, men det øger også antallet af analyser, der kan køres på en dag.
Selv om NA-inhiberingsassay er meget robust, er der en række kritiske trin, der skal udfyldes med yderligere omhu. Første, uregelmæssighed i NA inhibitorkoncentrationer kan forflytte hæmningskurverne og IC50-værdierne; Derfor bør omhyggelig opmærksomhed værebetalt ved fremstilling af NA inhibitorkoncentrationer. Sekund, præcise pipetteringstrin og præcis inkubationsperioder er afgørende for at opretholde ensartede resultater over hele assays; dette kan opnås ved anvendelse af kalibrerede pipetter og timere. Inddragelsen af kontrol vira i hver analyse muliggør også overvågningen af analysens ydeevne fra analyse til analyse og over lange perioder. Tredje fordi NA enzymaktiviteten af sæsonbetingede influenzavirus er optimal ved pH 6,5, den korrekte pH af assaypufferen er vigtig. Nogle rapporter har fundet, at anvendelsen af lavere pH kan betingelser forbedrer identifikation af influenza-varianter, såsom A (H7N9) variant indeholdende R292K mutationen 14, 15. Ændringen af pH i assaybufferen, vil imidlertid flytte IC50-værdierne, og dette kan komplicere sammenligningen af data inden laboratorier og mellem laboratorier. Andre modifikationer og fejlfinding, der kan være performed er anført i tabel 5.
NA-inhibitorer er den eneste klasse af godkendte antivirale stoffer, der i øjeblikket er effektive mod cirkulerende influenzavira. Indtil andre antivirale klasser bliver tilgængelige til klinisk brug, vil den antivirale følsomhed overvågning af cirkulerende influenzavira være fokuseret på NA-hæmmere alene. På grund af enkelhed og reproducerbarhed af resultaterne, at anvendelsen af NA inhiberingsassayet vurdere influenzavirus modtagelighed for NA-inhibitorer vil fortsætte.
The authors have nothing to disclose.
Den Melbourne WHO Collaborating Center for reference og forskning om Influenza er støttet af den australske regering Department of Health.
Influenza A and B viruses | Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs | ||
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | PTA-6500 | |
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Biosynth AG | M-5507 | |
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Sigma | M8639 | |
4-Methylumbelliferone (4-MU) | Sigma | M1381-25G | |
2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid) | Sigma | M8250-250G | |
Calcium Chloride (Ca Cl2) | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution) | Thermo Fisher Scientific | PIE28324 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | APS AJAX Finechem | 482-2.5KG | |
Absolute Ethanol | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
96-well clear flat-bottom plates | NUNC | 456537 | |
96-well U-bottom plates | Greiner Bio-one | 4650101 | |
8 channel deep well block | Pacific Laboratory Products | RES-MW8-HP | |
96-well deep plates, 2.0mL square wells | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
Plate sealers | Thermo Fisher Scientific | 236366 | |
Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
Single-channel pipettes (1 µL – 1000 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
Multi-channel pipettes | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 – 1250 µL volume) | |
Pipette tips (1 µL – 1250 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) | Greiner Bio-one | P7740-200EA and P7865-200EA | |
Pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | |
Centrifuge tubes 50 mL | BD Bioscience | 352070 | |
Racked tubes | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm | TermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
Ascent software | TermoFisher Scientific | 5185410CD | |
Incubator set at 37°C | Lab Supply | Biocell 1000 | |
Zanamivir | GlaxoSmithKline | Request directly from the company | |
Oseltamivir carboxylate | Roche | ||
Peramivir (BCX-1812) | BioCryst | ||
Laninamivir (R-125489) | Daiichi-Sankyo | ||
JASPR v1.2 | Influenza Division at the CDC Atlanta, USA | freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov) |