Espressione proteica ricombinante, cristallizzazione e studi biofisici di a<em> Bacillus</em> -conservato nucleotide pirofosforilasi, BcMazG
Summary
Bacillus anthracis è il patogeno obbligato di antrace fatale inalatorio, per cui studi di geni e proteine sono strettamente regolamentati. Un approccio alternativo è quello di studiare geni ortologi. Descriviamo studi biofisicochimici di un B. ortologo di B. anthracis in B. cereus , bc1531, che richiede una minima quantità di apparecchiature sperimentali e mancano gravi preoccupazioni di sicurezza.
Abstract
Per superare le restrizioni e le normative di sicurezza nello studio di geni e proteine da veri agenti patogeni, è possibile studiare i loro omologhi. Bacillus anthracis è un patogeno obbligato che provoca l'antrace fatale inalatorio. Bacillus cereus è considerato un utile modello per studiare B. anthracis a causa della sua stretta correlazione evolutiva. Il cluster gene ba1554 – ba1558 di B. anthracis è altamente conservato con il cluster bc1531 – bc1535 in B. cereus , così come con il cluster bt1364 – bt1368 in Bacillus thuringiensis, indicando il ruolo critico dei geni associati nel genere Bacillus . Questo manoscritto descrive metodi per preparare e caratterizzare un prodotto proteico del primo gene ( ba1554 ) dal cluster di gene in B. anthracis utilizzando una proteina ricombinante del suo ortologo in B. cereus , bc1531.
Introduction
L'espressione della proteina ricombinante è ampiamente utilizzata per superare i problemi associati a fonti di proteine naturali, quali limitate quantità di proteine e contaminazioni nocive. Inoltre, negli studi sui geni patogeni e sulle proteine, può essere utilizzato un ceppo di laboratorio alternativo che non richiede ulteriori precauzioni di sicurezza. Ad esempio, Bacillus cereus è un modello utile per studiare Bacillus anthracis a causa della loro stretta relazione evolutiva 1 .
B. anthracis è un patogeno obbligatorio che provoca l'antrace fatale per via inalatoria negli esseri umani e nel bestiame e può essere potenzialmente utilizzato come bioweapon 2 . Pertanto, gli studi di laboratorio su B. anthracis sono strettamente disciplinati dai centri statunitensi per il controllo delle malattie, che richiedono pratiche di livello di biosicurezza 3 (BSL-3), che prevedono che l'area di laboratorio sia segregata con una pressione negativa della stanza. A differenza di B. anthracis </eM>, B. cereus è classificato come agente BSL-1 e quindi ha minime preoccupazioni di sicurezza. B. cereus è un patogeno opportunistico che, dopo l'infezione, provoca avvelenamenti alimentari che possono essere trattati senza assistenza medica. Tuttavia, poiché B. cereus condivide molti geni critici con B. anthracis , le funzioni delle proteine di B. anthracis possono essere studiate utilizzando gli omologhi corrispondenti di B. cereus 1 .
Il cluster di gene ba1554 – ba1558 di B. anthracis è altamente conservato con il cluster bc1531 – bc1535 Di B. cereus , così come con il cluster bt1364-bt1368 di Bacillus thuringiensis , in termini di organizzazione e sequenza del gene. Inoltre, i primi geni ( ba1554 , bc1531 e bt1364 ) dei rispettivi cluster sono assolutamente conservati ( cioè l' identità della sequenza nucleotidica del 100%), implyiUn ruolo critico del prodotto genico nelle specie di Bacillus . A causa della sua collocazione in questi cluster di geni, ba1554 è stato erroneamente identificato come un regolatore di trascrizione supposto 3 . Tuttavia, l'analisi della sequenza di aminoacidi del prodotto ba1554 indica che appartiene alla famiglia MazG, che ha attività di pirofosfosforrolasi nucleotidica e non è associata all'attività del fattore di trascrizione 4 , 5 . Sebbene le proteine appartenenti alla famiglia MazG siano diverse rispetto alla sequenza e alla lunghezza complessiva, condividono un dominio MazG con un residuo di 100 residui caratterizzato da un motivo EXXE 12-28 EXXD ("X" indica qualsiasi residuo di aminoacidi e il numero Indica il numero di residui X).
Il dominio MazG non sempre rappresenta direttamente una certa attività catalitica. Un membro MazG di Escherichia coli (EcMazG) possiede due domini MazG, ma suIl dominio C-terminale MazG è enzimaticamente attivo 6 . Inoltre, la specificità del substrato degli enzimi MazG varia da non-specifici nucleosid trifosfati (per EcMazG) a specifici dCTP / dATP (per MazG associati all'integrina) e dUTP (per dUTPasi) 6 , 7 , 8 , 9 . Pertanto, sono necessarie analisi biofisico-chimiche della proteina BA1554 per confermare l'attività NTPase e decifrare la sua specificità del substrato.
Qui forniamo un protocollo passo dopo passo che la maggior parte dei laboratori senza un impianto BSL-3 può seguire per caratterizzare il prodotto proteico del gene B. cereus bc1531 , che è un ortologo di B. anthracis ba1554 , a livello molecolare. Brevemente, il ricombinante BC1531 (rBC1531) è stato espresso in E. coli e purificato utilizzando un tag di affinità. Per gli esperimenti cristallografici a raggi X, i cristalliZione delle proteine rBC1531 sono state proiettate e ottimizzate. Per valutare l'attività enzimatica del rBC1531, l'attività di NTPase è stata monitorata in modo colorimetrico per evitare nucleotidi etichettati radioattivamente che sono stati convenzionalmente utilizzati. Infine, le analisi dei dati biofisicochimici ottenuti ci hanno permesso di determinare lo stato di oligomerizzazione e i parametri catalitici di rBC1531, così come ottenere dati di diffrazione dei raggi X dal cristallo rBC1531.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I set di dati di diffrazione dei raggi X sono stati raccolti nel beamline 7A del laboratorio Accelerator Pohang (Corea). Questo studio è stato sostenuto dal programma di ricerca scientifica di base amministrato dalla Fondazione Nazionale di Ricerca della Corea (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT e pianificazione futura (2015R1A1A01057574 a MH).
Materials
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
References
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