組換えタンパク質の発現、結晶化、および生物物理学的研究<em>バチルス</em>保有ヌクレオチドピロホスホリラーゼ、BcMazG
Summary
Bacillus anthracisは致命的な吸入炭疽菌の必須病原体であるため、その遺伝子やタンパク質の研究は厳格に規制されています。代わりのアプローチは、オーソロガス遺伝子を研究することである。最小の実験装置を必要とし、重大な安全性の懸念がないB.セレウスの B. anthracisオルソログ（bc1531）の生物物理化学的研究を記載する。
Abstract
真の病原体から遺伝子やタンパク質を研究する際の安全規制や規制を克服するために、それらの同族体を研究することができます。 Bacillus anthracisは致命的な吸入炭疽菌を引き起こす必須の病原体である。 Bacillus cereusは、その近縁の進化的関係のためにB. anthracisを研究するための有用なモデルと考えられている。 炭疽菌の遺伝子クラスターba1554 – ba1558はバチルス ・セレウスの bc1531-bc1535クラスターならびにバチルス・チューリンゲンシスの bt1364-bt1368クラスターと高度に保存されており、 バチルス属の関連遺伝子の重要な役割を示している。この原稿ではB. cereusの bc1531のオルソログの組換えタンパク質を用いて炭疽菌の遺伝子クラスターからの第1遺伝子（ ba1554 ）のタンパク質産物を調製し特徴付ける方法を説明しています。
Introduction
組換えタンパク質発現は、限られたタンパク質量および有害な汚染などの天然のタンパク質源に関連する問題を克服するために広く使用されている。さらに、病原性遺伝子およびタンパク質の研究において、追加の安全予防措置を必要としない別の実験室株を利用することができる。例えば、 Bacillus cereusは、 Bacillus anthracisをそれらの近い進化的関係のために研究するための有用なモデルである1 。
炭疽菌はヒトや家畜の致命的な吸入炭疽菌を引き起こす必須の病原体であり、潜在的に生物兵器として使用することができる2 。したがって、 B. anthracisに関する実験室研究は、実験室領域が負の室内圧力で隔離されることを義務づけるバイオセーフティーレベル3（BSL-3）プラクティスを必要とする米疾病管理センター（NHS）によって厳格に規制されている。 B. anthracisとは対照的に</eB.セレウスはBSL-1剤に分類され、したがって安全性の懸念が最小限である。 B.セレウスは日和見病原体であり、感染時に食中毒を引き起こし、医学的援助なしに治療することができる。しかしB. cereusはB. anthracisと多くの重要な遺伝子を共有しているのでB. anthracisタンパク質の機能はB. cereus 1の対応する同族体を用いて研究することができる。
B. anthracisの ba1554 – ba1558遺伝子クラスターは、 bc1531 – bc1535クラスターと高度に保存されています Bacillus thuringiensisの bt1364-bt1368クラスターと同様に 、遺伝子構成および配列の点で、B。さらに、それぞれのクラスターの最初の遺伝子（ ba1554 、 bc1531 、およびbt1364 ）は、完全に保存されている（ すなわち、 100％のヌクレオチド配列同一性）、implyiBacillus種における遺伝子産物の重要な役割を担う。これらの遺伝子クラスターにおけるその位置のために、ba1554は、推定転写調節因子3として誤って同定された。しかしながら、 ba1554産物のアミノ酸配列分析は、それがヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ活性を有し、転写因子活性に関連しないMazGファミリーに属することを示している4,5。 MazGファミリーに属するタンパク質は、全配列および長さに関して多様であるが、EXXE 12-28EXXDモチーフによって特徴付けられる共通の約100残基のMazGドメインを共有する（「X」は任意のアミノ酸残基を表し、 X残基の数を示す）。
MazGドメインは、必ずしも特定の触媒活性を直接的に説明するとは限らない。 エシェリヒア・コリ （EcMazG） 由来の MazGメンバーは、2つのMazGドメインを有するが、C末端のMazGドメインは酵素的に活性である6 。さらに、MazG酵素の基質特異性は、非特異的ヌクレオシド三リン酸（EcMazGの場合）から特異的dCTP / dATP（インテグリン関連MazGの場合）およびdUTP（dUTPaseの場合）6,7,8,9まで変化する。したがって、そのNTPアーゼ活性を確認し、その基質特異性を解明するためには、BA1554タンパク質の生物物理化学的分析が必要である。
ここでは、BSL-3機能を持たない大部分の研究室が分子レベルでB. anthracis ba1554のオルソログであるB. cereus bc1531遺伝子のタンパク質産物を特徴づけることができる段階的プロトコールを提供する。簡潔には、組換えBC1531（rBC1531）を大腸菌で発現させ、親和性タグを用いて精製した。 X線結晶学実験のために、結晶rBC1531タンパク質のzation条件をスクリーニングし最適化した。 rBC1531の酵素活性を評価するために、NTPアーゼ活性を比色分析して、従来使用されていた放射性標識ヌクレオチドを回避した。最後に、得られた生物物理化学的データの分析により、rBC1531のオリゴマー化状態および触媒パラメータを決定することができ、ならびにrBC1531結晶からX線回折データを得ることができた。
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
X線回折データセットは、浦項加速器研究所（韓国）のビームライン7Aで収集した。この研究は、科学技術省、将来計画（2015R1A1A01057574〜MH）の資金提供を受けて、韓国国立研究財団（NRF）が運営する基礎科学研究プログラムの支援を受けて行われた。
Materials
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
References
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