Rekombinant Proteinuttryck, Kristallisation och Biofysiska Studier av a<em> Bacillus</em> -konserverad nukleotidpyrofosforylas, BcMazG
Summary
Bacillusantracis är den obligatoriska patogenen för dödlig inhalationsantrax, så studier av dess gener och proteiner är strikt reglerade. Ett alternativt tillvägagångssätt är att studera ortopologiska gener. Vi beskriver biofysikkemiska studier av en B. antracis ortholog i B. cereus , bc1531, som kräver minimal experimentell utrustning och saknar allvarliga säkerhetsproblem.
Abstract
För att övervinna säkerhetsrestriktioner och föreskrifter när man studerar gener och proteiner från sanna patogener kan deras homologer studeras. Bacillus antracis är en obligatorisk patogen som orsakar dödlig inandningsbrandbrand. Bacillus cereus anses vara en användbar modell för att studera B. antracis på grund av dess nära utvecklingsrelation. Genklumpen ba1554 – ba1558 av B. antracis är starkt konserverad med bc1531 – bc1535- klustret i B. cereus , liksom med bt1364-bt1368- klustret i Bacillus thuringiensis, vilket indikerar den kritiska rollen hos de associerade generna i Bacillus- släktet. Detta manuskript beskriver metoder för att bereda och karakterisera en proteinprodukt från den första genen ( ba1554 ) från genklustret i B. antracis med användning av ett rekombinant protein av dess ortholog i B. cereus , bc1531.
Introduction
Rekombinant proteinuttryck används i stor utsträckning för att övervinna problem som hör samman med naturliga proteinkällor, såsom begränsade proteinkvantiteter och skadlig kontaminering. Vidare kan i en studie av patogena gener och proteiner användas en alternativ laboratoriestam som inte kräver ytterligare säkerhetsåtgärder. Till exempel är Bacillus cereus en användbar modell för att studera Bacillus antracis på grund av deras nära evolutionära förhållande 1 .
B. antracis är en obligatorisk patogen som orsakar dödlig inhalationsantrax hos människor och boskap och kan potentiellt användas som en bioweapon 2 . Laboratoriestudier på B. antracis regleras därför strängt av de amerikanska centrumen för sjukdomskontroll, som kräver biosäkerhetsnivå 3 (BSL-3) praxis, vilket innebär att laboratorieområdet ska segregeras med negativt rums tryck. I motsats till B. antracis </eM>, B. cereus är kategoriserad som ett BSL-1-medel och har sålunda minimala säkerhetsproblem. B. cereus är en opportunistisk patogen som vid infektion orsakar matförgiftning som kan behandlas utan medicinsk hjälp. Eftersom B. cereus delar många kritiska gener med B. antracis kan funktionerna för B. antracisproteiner studeras med motsvarande homologer av B. cereus 1 .
Ba1554 – ba1558 – genklustret av B. antracis är starkt bevarat med bc1531 – bc1535-klyftan Av B. cereus , liksom med bt1364-bt1368- klustret av Bacillus thuringiensis , vad gäller genorganisation och sekvens. Vidare är de första generna ( ba1554 , bc1531 och bt1364 ) av respektive kluster absolut bevarade ( dvs 100% nukleotidsekvensidentitet), implNg en kritisk roll för genprodukten i Bacillus- arten. På grund av sin plats i dessa genkluster var ba1554 felidentifierad som en antydande transkriptionsregulator 3 . En aminosyrasekvensanalys av ba1554-produkten indikerar dock att den tillhör MazG-familjen, som har nukleotidpyrofoshydrolasaktivitet och inte är associerad med transkriptionsfaktoraktivitet 4 , 5 . Även om proteiner som tillhör MazG-familjen är olika med avseende på övergripande sekvens och längd, delar de en gemensam MazG-domän med 100 rester, kännetecknad av ett EXXE 12-28 EXXD-motiv ("X" står för vilken aminosyrarest som helst och numret Anger antalet X-rester).
MazG-domänen ansvarar inte alltid för en viss katalytisk aktivitet. En MazG-medlem från Escherichia coli (EcMazG) har två MazG-domäner, men påLi den C-terminala MazG-domänen är enzymatisk aktiv 6 . Dessutom varierar substratspecificiteten hos MazG-enzymer från icke-specifika nukleosidtrifosfater (för EcMazG) till specifika dCTP / dATP (för integrin-associerad MazG) och dUTP (för dUTPaser) 6 , 7 , 8 , 9 . Därför är biofysikologiska analyser av BA1554-proteinet nödvändiga för att bekräfta dess NTPasaktivitet och att dechiffrera dess substratspecificitet.
Här tillhandahåller vi ett steg för steg protokoll som de flesta laboratorier utan en BSL-3-anläggning kan följa för att karakterisera proteinprodukten från B. cereus bc1531- genen, som är en ortholog av B. antracis ba1554 , på molekylär nivå. I korthet uttrycktes rekombinant BC1531 (rBC1531) i E. coli och renades med användning av en affinitetsmärkning. För röntgenkristallografiska experiment, kristalliZationbetingelserna för rBC1531-proteinet screenades och optimerades. För att bedöma den enzymatiska aktiviteten hos rBC1531 övervakades NTPasaktiviteten kolorimetriskt för att undvika radioaktivt märkta nukleotider som konventionellt har använts. Slutligen möjliggjorde analyser av de erhållna biofysikemiska data oss att bestämma oligomeriseringstillståndet och katalytiska parametrarna för rBC1531, såväl som att erhålla röntgendiffraktionsdata från rBC1531-kristallen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Röntgendiffraktionsdataseten samlades in vid strålningslinjen 7A i Pohang Accelerator Laboratory (Korea). Denna studie stöddes av Grundforskningsprogrammet administrerat genom Nationella forskningsstiftelsen i Korea, finansierat av ministeriet för vetenskap, IKT och framtidsplanering (2015R1A1A01057574 till MH).
Materials
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
References
- Ivanova, N., et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature. 423, 87-91 (2003).
- Spencer, R. C. Bacillus anthracis. J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).
- Deli, A., et al. LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis. FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).
- Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. MazG — a regulator of programmed cell death in Escherichia coli. Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).
- Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. House cleaning, a part of good housekeeping. Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).
- Lee, S., et al. Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response. J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).
- Moroz, O. V., et al. Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential "house-cleaning" functions. J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).
- Robinson, A., et al. A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype. Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).
- Moroz, O. V., et al. The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the "basic module" for dimeric d(C/U)TPases. J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory Manual. 1, (2012).
- Brown, T. A. . Gene cloning an introduction. , (1986).
- Kim, M. I., Hong, M. Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase. Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).
- Sheehan, D. . Physical biochemistry: Principles and applications. , (2009).
- Lesley, S. A., Wilson, I. A. Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics. J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).
- Jeon, Y. J., et al. Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase. J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).
